Détection de protéines par diffusion Raman exaltée par effet de pointe (TERS)

La concentration locale des messagers chimiques sécrétés par les cellules peut être mesurée afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires liés à diverses maladies, dont les métastases du cancer. De nouvelles techniques analytiques sont requises pour effectuer ces mesures locales de marqueurs biologiques à proximité des cellules. Ce mémoire présentera le développement d’une nouvelle technique basée sur la réponse plasmonique sur des leviers AFM, permettant d’étudier les réactions chimiques et biologiques à la surface des leviers grâce au phénomène de résonance des plasmons de surface (SPR), ainsi qu’à la diffusion Raman exaltée par effet de pointe (TERS). En effet, il est possible de localiser l’amplification du signal Raman à la pointe d’un levier AFM, tout comme le principe de la diffusion Raman exaltée par effet de surface (SERS) basée sur la diffusion de la lumière par des nanoparticules métalliques, et permettant une large amplification du signal Raman. La surface du levier est recouverte d’une nano-couche métallique d’or, suivi par des réactions biologiques pour l’immobilisation d’un récepteur moléculaire, créant ainsi un biocapteur sur la pointe du levier. Une détection secondaire utilisant des nanoparticules d’or conjuguées à un anticorps secondaire permet également une amplification du signal SPR et Raman lors de la détection d’antigène. Ce mémoire démontrera le développement et la validation de la détection de l’immunoglobuline G (IgG) sur la pointe du levier AFM.Dans des projets futurs, cette nouvelle technique d’instrumentation et d’imagerie sera optimisée grâce à la création d’un micro-détecteur protéique généralement adapté pour l’étude de la communication cellulaire. En intégrant le signal SPR à la microscopie AFM, il sera alors possible de développer des biocapteurs SPR couplés à une sonde à balayage, ce qui permettra d’effectuer une analyse topographique et de l’environnement chimique d’échantillons cellulaires en temps réel, pour la mesure des messagers moléculaires sécrétés dans la matrice extracellulaire, lors de la communication cellulaire.Measurement of the local concentration of chemical messengers secreted by cells may give a better understanding of molecular mechanisms related to different diseases, such as cancer metastasis. Current techniques are not suited to perform such measurements and thus, new analytical techniques must be developed. This Master’s thesis reports the development of a new technique based on the plasmonic response of atomic force microscopy (AFM) tips, which will ultimately allow monitoring of chemical and biological molecules on the surface of a cantilever by use of surface plasmon resonance (SPR) and tip-enhanced Raman scattering (TERS). Indeed, it is possible to localize the enhancement of the Raman signal on the AFM tip using principles associated to surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS), based on the absorption of light by nanometer-sized metal particles, resulting in a large enhancement of the Raman signal. The AFM tip was constructed by the deposition of a nanometer-size gold layer, followed by the assembly of a biosensor with a biomolecular receptor. Gold nanoparticles (AuNPs) conjugated with a secondary antibody served as the secondary detection step. In addition, the use of the gold nanoparticles for antigen detection allows an amplification of the SPR and Raman signals. This Master’s thesis will demonstrate the development and validation of a biosensor for immunoglobuline G (IgG) at the tip of an AFM cantilever.This thesis sets the basis for future projects, where this new imaging technique will be developed for monitoring cellular communication by exploiting the plasmonic signal at the AFM tip. Different biosensors will then be developed and coupled to an AFM probe for scanning the chemical environment and detect in real-time chemical messengers secreted in the extracellular matrix in cellular communication

Plasmonic Nanopipette Biosensor

Integrating a SERS immunoassay on a plasmonic “patch clamp” nanopipette enabled nanobiosensing for the detection of IgG. A SERS response was obtained using a sandwich assay benefiting from plasmon coupling between a capture Au nanoparticle (AuNP) on a nanotip and a second AuNP modified with a Raman active reporter and an antibody selective for IgG. The impact of nanoparticle shape and surface coverage was investigated alongside the choice of Raman active reporter, deposition pH, and plasmonic coupling, in an attempt to fully understand the plasmonic properties of nanopipettes and to optimize the nanobiosensor for the detection of IgG. These probes will find applications in various fields due to their nanoscale size leading to the possibility of spatially and temporally addressing their location near cells to monitor secretion of biomolecules