Die Wirkung des Komplementregulators Properdin auf gestresste retinale Pigmentepithelzellen

Der Lichteinfall im Auge, der uns die visuelle Wahrnehmung unserer Umgebung ermöglicht, führt in der Retina zu einer Belastung der Zellen mit oxidativem Stress. Als Reaktion darauf kommt es zur Aktivierung des Komplementsystems, welches eine bedeutende Rolle in der Pathogenese verschiedener Augenerkrankungen spielt. In der vorliegenden Dissertation werden Forschungen zur Funktion des Komplement- stabilisierenden Modulators Properdin an ARPE-19 Zellen, einer humanen retinalen Pigmentepithel (RPE) -Zelllinie, unter oxidativem Stress angestellt. Zunächst wurde eine RPE-Kultivierungsmethode herausgearbeitet, durch die die zellmorphologischen Merkmale von ARPE-19 Zellen in vitro deutlicher realisiert werden konnten, als durch die bisher in der Arbeitsgruppe etablierte Kultivierungsmethode. Durch eine ZO1- Färbung konnte für die pigmentierten Zellen eine markantere Ausbildung der RPE- typischen „Pflasterstein-Form“ und der Zell-Zell-Kontakte, die zur Ausbildung einer epithelialen Einzelzellschicht führen, sichtbar gemacht werden. Auch in Hinsicht auf die Werte für den transepithelialen Widerstand und die Membranfläche waren die Zellen der neuen Kultivierungsmethode überlegen. Nichtsdestotrotz konnte im Vergleich der Zellen beider Kultivierungsmethoden unter oxidativen Stressbedingungen eine korrelierende Expressionsänderung der Komplementfaktoren ctsl, il-1β, c5aR und nlrp3 mittels qPCR festgestellt werden. ARPE-19 Zellen, anhand der neuen Methode kultiviert und weiterhin oxidativem Stress ausgesetzt, wurden daraufhin mit exogenem Properdin behandelt. Dabei wurde durch Immunfärbungen und Western Blot ersichtlich, dass exogenes Properdin an die gestressten Zellen bindet. Auf mRNA-Ebene induzierte das exogene Properdin nach 4 h eine Steigerung der Expression für die Komplementfaktoren il-18, ctsl und cfp, sowie eine Verringerung für nlrp3. Durch einen Sandwich-ELISA wurde im apikalen Überstand vermehrt Properdin, das von der Zelle selbst gebildet wurde, detektiert. So konnte geschlussfolgert werden, dass Properdin sich selbst in einer Rückkopplungsschleife reguliert, indem es an die Zellen bindet, deren Expression beeinflusst und die apikale Sekretion von Properdin steigert, welches wiederum an die Zelle bindet. Zusätzlich konnte in Hinsicht auf die apikale Sekretion der ARPE-19 Zellen ein steigernder Effekt des exogenen Properdins auf die Ausschüttung der Komplementfaktoren C1q, MBL, CFD und CFI mittels Multiplex-ELISA beobachtet werden. Im nächsten Schritt wurden die ARPE-19 Zellen mit Serum behandelt, welches alle Bestandteile, außer Properdin, enthielt. Dies führte zu einer zeitabhängigen Erhöhung der Expression von cfp, cfd und c4 nach 4 h im Vergleich zu lediglich gestressten Zellen. Die Komplettierung des Serums durch Properdin hatte auf dieses Ergebnis keine signifikanten Auswirkungen. Jedoch wurde die durch exogenes Properdin deutlich gesteigerte Sekretion von Properdin durch die Beteiligung der anderen Faktoren aus dem Serum abgeschwächt. Der Selbstregulationszyklus von Properdin wird also in Anwesenheit der Gänze von Komplementfaktoren durch andere Effekte überlagert. In der Gesamtheit konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass der singuläre Komplementregulator Properdin die Zellphysiologie von gestressten RPE-Zellen regulieren kann, diese Wirkung aber im Zusammenspiel aller Serumproteine gegenreguliert wird um ein homöostatisches Gleichgewicht zu gewährleisten

Oxidative stress increased endogenous complement-dependent inflammatory and angiogenic responses in retinal pigment epithelial cells - independent from exogenous complement sources

Oxidative stress-induced damage of the retinal pigment epithelium (RPE) and chronic inflammation have been suggested as major contributors to a range of retinal diseases. Here, we examined the effects of oxidative stress on endogenous complement components and proinflammatory and angiogenic responses in RPE cells. ARPE-19 cells exposed for 1-48 h to H2O2 had reduced cell-cell contact and increased markers for epithelial-mesenchymal transition but showed insignificant cell death. Stressed ARPE-19 cells increased the expression of complement receptors CR3 (subunit CD11b) and C5aR1. CD11b was colocalized with cell-derived complement protein C3, which was present in its activated form in ARPE-19 cells. C3, as well as its regulators complement factor H (CFH) and properdin, accumulated in the ARPE-19 cells after oxidative stress independently of external complement sources. This cell-associated complement accumulation was accompanied by increased nlrp3 and foxp3 expression and the subsequently enhanced secretion of proinflammatory and proangiogenic factors. The complement-associated ARPE-19 reaction to oxidative stress, which was independent of exogenous complement sources, was further augmented by the poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor olaparib. Our results indicate that ARPE-19 cell-derived complement proteins and receptors are involved in ARPE-19 cell homeostasis following oxidative stress and should be considered as targets for treatment development for retinal degeneration

Oxidative Stress Increases Endogenous Complement-Dependent Inflammatory and Angiogenic Responses in Retinal Pigment Epithelial Cells Independently of Exogenous Complement Sources.

Oxidative stress-induced damage of the retinal pigment epithelium (RPE) and chronic inflammation have been suggested as major contributors to a range of retinal diseases. Here, we examined the effects of oxidative stress on endogenous complement components and proinflammatory and angiogenic responses in RPE cells. ARPE-19 cells exposed for 1-48 h to H2O2 had reduced cell-cell contact and increased markers for epithelial-mesenchymal transition but showed insignificant cell death. Stressed ARPE-19 cells increased the expression of complement receptors CR3 (subunit CD11b) and C5aR1. CD11b was colocalized with cell-derived complement protein C3, which was present in its activated form in ARPE-19 cells. C3, as well as its regulators complement factor H (CFH) and properdin, accumulated in the ARPE-19 cells after oxidative stress independently of external complement sources. This cell-associated complement accumulation was accompanied by increased nlrp3 and foxp3 expression and the subsequently enhanced secretion of proinflammatory and proangiogenic factors. The complement-associated ARPE-19 reaction to oxidative stress, which was independent of exogenous complement sources, was further augmented by the poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor olaparib. Our results indicate that ARPE-19 cell-derived complement proteins and receptors are involved in ARPE-19 cell homeostasis following oxidative stress and should be considered as targets for treatment development for retinal degeneration