Inhibition der Rekrutierung reninbildender Zellen durch systemische Blockade von Stickstoffmonoxid

Eine Zu- oder Abnahme der Anzahl reninbildender Zellen in der Niere ist verschiedenen Einflüssen unterworfen und basiert auf einem metaplastischen Transformationsvorgang. Dieser als Rekrutierung bezeichnete Mechanismus ist auf eine Umwandlung von Renin-Vorläufer- zu reninbildenden Zellen zurückzuführen, wobei sowohl glatte Muskelzellen als auch extraglomeruläre Mesangiumszellen als Vorläuferzellen fungieren können. Bei Stimulation des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems, beispielsweise durch Salzrestriktion oder Hypotension, kommt es zu einer Steigerung dieser Rekrutierungsvorgänge in retrograder Richtung vom vaskulären Pol der Glomeruli zu den großen renalen Gefäßen (Barajas, 1979; Taugner et al., 1984). Welchen Regulationsfaktoren dieser Vorgang unterworfen ist, ist bisweilen noch weitgehend unbekannt, jedoch scheint es wahrscheinlich, dass NO als wichtigster Mediator der Reninsekretion, auch hinsichtlich des Rekrutierungsmechanismus eine bedeutende Rolle spielt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Relevanz von endothelial gebildetem Stickstoff-monoxid für die Rekrutierung reninbildender Zellen herausgearbeitet werden. Darüber hinaus stellte sich die Frage, inwiefern dieser Einfluss ein indirekter, vom Blutdruck abhängiger, ist oder es es sich vielmehr um eine direkte Wirkung des NO auf die reninbildenden Zellen, beispielsweise via cGMP-vermittelter Signaltransduktionsmechanismen, handelt. Zu diesem Zweck wurden Versuchstiere unterschiedlichen Genotyps hinsichtlich ihres Rekrutierungsverhaltens untersucht. Eine Kombinationsbehandlung aus salzarmer Diät und ACE-Hemmung mittels Enalapril (LS/E) wurde allen Tieren verabreicht, um eine Stimulation des RAAS zu erreichen. Die Wirkung der Salzrestriktion auf die Reninkonzentration beruht dabei auf Macula Densa-getriggerten Regulationsfaktoren, welche mit Hilfe von Salzsensoren den NaCl-Gehalt im tubulären System der Niere registrieren und in Abhängigkeit davon durch verschiedene Mediatoren Einfluss auf die Reninfreisetzung nehmen. Die ACE-Inhibition mittels Enalapril beruht auf einer Blockade der Umwandlung von ANG I zu ANG II und damit einer Hemmung der ANG II-vermittelten Vasokonstriktion und Inhibition der Reninfreisetzung der JG-Zellen als Teil der negativen Rückkopplungsschleife des RAAS. Ein Fehlen dieses hemmenden Effekts begünstigt demnach die Reninsekretion. Mit Hilfe fluoreszenzgefärbter histologischer Bilder konnte das Rekrutierungsmuster der verschiedenen Genotypen verfolgt und untersucht werden. Die computer-gesteuerte dreidimensionale Aufarbeitung ausgewählter Gefäßbaumabschnitte ist der zweidimensionalen Darstellung in vielerlei Hinsicht überlegen und erlaubt die genaue Verfolgung des Rekrutierungshergangs sowie die Untersuchung der Verteilung reninbildender Zellen im dreidimensionalen Raum. Zusätzlich zu dieser semiquantitativen Darstellung der reninbildenden Zellen erfolgte eine Renin-mRNA-Analyse zur quantitativen Bestimmung des Reningehaltes sowie auch die Messung des Blutdrucks der einzelnen Versuchstiere. Neben wildtypischen Mäusen, wurden mittels dieser Methoden zudem eNOS-Knockout-, AT1a-Knockout-, sowie Cx40-defiziente Tiere im Hinblick auf ihr Rekrutierungsverhalten und ihre Blutdruckparameter untersucht. Wildtypische Mäuse ließen dabei in Folge der LS/E-Behandlung ein deutliches retrogrades Rekrutierungsmuster entlang der afferenten Arteriole erkennen, welches auf die Transformation glatter Gefäßmuskelzellen zu reninbildenden Zellen zurückzuführen ist. Auch die mRNA-Werte zeigten eine signifikante Zunahme der Reninkonzentration um den Faktor 14 nach Stimulation des RAAS. Derartiges konnte bei eNOS-defizienten Tieren, bei denen aufgrund eines genetischen Knockouts die Bildung von endothelialem NO blockiert ist, nicht beobachtet werden. Aus den 3D-Rekonstruktionen sowie den mRNA-Analysen geht deutlich hervor, dass die eNOS-Knockouttiere auf die LS/E-Gabe zwar mit einer Zunahme der Reninkonzentration reagieren – die Renin-mRNA-Analyse erbrachte eine Zunahme der Reninkonzentration um den Faktor 7im Verlgeich zu unbehandelten eNOS-Knockouttieren – dies ist jedoch, wie aus den 3D-Modellen deutlich hervorgeht, auf eine präglomeruläre Clusterbildung und nicht auf eine retrograde Reninzellrekrutierung zurückzuführen. Das Fehlen von endothelial gebildetem NO ist demnach mit einem fehlenden Rekrutierungsmechanismus vergesellschaftet, was die Bedeutung von NO für diesen Vorgang unterstreicht. Die AT1a-Knockouttiere lieferten bereits ohne vorherige Stimulation signifikant höhere Renin-mRNA-Werte als die wildtypischen Referenztiere. Da aufgrund des genetischen Knockouts die ANG II-Wirkung an AT1a-Rezeptoren bei diesem Tiermodell fehlt, wurde auf die Zugabe eines ACE-Inhibitors verzichtet. Renin-zellrekrutierung zeigt sich hier bereits ohne LS-Behandlung. Eine Niedrigsalz-Diät führt bei den AT1a-Knockouttieren zu einer enormen Rekrutierungssteigerung, welche sich bis in die Interlobulararterien verfolgen lässt. Im Vergleich zum unbehandelten AT1a-Knockout zeigte sich in der Renin-mRNA-Analyse eine 5fache Steigerung des Reningehaltes durch LS-Diät. Auch die Cx40-defizienten Tiere reagierten auf die Gabe von LS/E mit einer deutlichen Steigerung der Reninkonzentration um das 18fache im Vergleich zu unbehandelten Cx40-Knockoutmäusen sowie auch eine Zunahme des Rekturierungsverhaltens. Dieses findet jedoch nicht in retrograder Richtung entlang der arteriellen Gefäße statt, sondern ektopisch im extraglomerulären Mesangium, was die Bedeutung von Cx40 als Bestandteil der Gap Junctions zwischen den reninbildenden Zellen unterstreicht. Um die Relevanz von NO für die Reninzellrekrutierung zu untersuchen, wurde einem Teil der Versuchstiere zusätzlich zur LS/E-Behandlung der NOS-Inhibitor L-NAME verabreicht, welcher unspezifisch alle NOS-Isoformen inhibiert und somit pharmakologisch die NO-Wirkung systemisch blockiert. Derartig behandelte Mäuse zeigten eine signifikant geringere bzw. eine fehlende Zunahme ihres Reningehaltes durch LS/E-Gabe als die Tiere gleichen Genotyps ohne NO-Blockade. So konnte bei wildtypischen Tieren eine 14fache Steigerung des Reningehaltes durch LS/E-Behandlung erreicht werden, die zusätzliche Gabe von L-NAME hingegen erbrachte eine nur 5fache Zunahme des Renin-mRNA-Gehaltes. Eine ähnliche Beobachtung ließ sich bei den AT1a-Knockouttieren machen. Hier führte die Niedrigsalzdiät zu einer 5fachen Steigerung des Renin-mRNA-Gehaltes im Vergleich zu unbehandelten AT1a-Knockoutmäusen, wohingegen die simultane L-NAME-Substitution mit keiner wesentlichen Steigerung der Reninkonzentration vergesellschaftet war. Der Cx40-Knockout erbrachte vergleichbare Resultate. Hier führte die LS/E-Substitution zu einer 18fachen Zunahme des Renin-mRNA-Gehaltes im Vergleich zum unbehandelten Cx40-Knockout, wohingegen die zusätzliche L-NAME-Gabe keine nachweisbare Steigerung der Renin-mRNA-Konzentration erbrachte. Dieses Phänomen war beim eNOS-defizienten Mausmodell jedoch nicht zu beobachten. Dieses lieferte in der 3D-Rekonstruktion keinerlei Veränderung hinsichtlich seines Reninexpressionsmusters nach L-NAME-Gabe im Vergleich zu den Referenztieren. Eine L-NAME-Wirkung konnte demnach im eNOS-Knockout nicht beobachtet werden. Die Analyse des Renin-mRNA-Gehaltes bestätigte dieses Ergebnis. Während die LS/E-Behandlung der eNOS-Knockouttiere zu einer 7fachen Zunahme des Reningehaltes führte, zeigte sich durch gleichzeitige L-NAME-Subsitution keine signifikant verringerte Reninkonzentration. Im Gegenteil führte diese Maßnahme sogar zu einer – wenn auch nicht signifikanten – Zunahme des Renin-mRNA-Gehaltes. Das Fehlen der Reninzellrekrutierung sowie der fehlende Einfluss der systemischen NO-Blockade im eNOS-Knockoutmodell liefert somit einen wichtigen Hinweis darauf, dass die Transformation von Renin-Vorläufer- zu reninbildenden Zellen ein von endothelial gebildetem NO abhängiger Mechanismus ist, während iNOS und nNOS eine eher untergeordnete Rolle zu spielen scheinen. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war darüber hinaus, die Ergebnisse der mRNA-Analyse sowie der Rekonstruktionsverfahren mit den Blutdruckparametern der Versuchstiere zu vergleichen. Dabei konnte eine deutlich inverse Relation zwischen Renin-mRNA-Gehalt und systolischem Blutdruck gezeigt werden. Hohe mRNA-Level sind demnach mit einem geringen, niedrige mRNA-Level mit einem hohen systolischen Blutdruck vergesellschaftet. Diese Resultate weisen auf einen – zumindest teilweise – indirekten, vom Blutdruck abhängigen, Einfluss von NO auf die Reninzellrekrutierung hin. NO bewirkt als starker Vasodilatator eine Weitstellung der Gefäße und auf diese Weise eine Blutdrucksenkung. Dies wiederum führt aufgrund einer verminderten renalen Perfusion zur Stimulation der Reninsynthese infolge einer vermehrten Reninzellrekrutierung. Im Umkehrschluss führt – wie in dieser Arbeit dargestellt - die systemische Blockade von NO mittels L-NAME zu einer Zunahme des systolischen Blutdrucks und infolge dessen zu einer verminderten Reninzellrekrutierung. Endothelial gebildetes NO triggert somit durch eine Senkung des systemischen Blutdrucks die Transformation von Renin-Vorläufer- zu reninsynthetisierenden Zellen. Auf welche Art und Weise die Modulation des Blutdrucks derartige Transformationsvorgänge zu bewirken vermag, ist ist jedoch noch weitestgehend unklar. Ob eine zusätzliche direkte cGMP-abhängige Wirkung von NO auf die reninbildenden Zellen des juxtaglomerulären Apparates besteht, ist durch die Ergebnisse dieser Arbeit nicht auszuschließen und wird Gegenstand künftiger Untersuchungen sein