New approaches for the biotechnological application of the maize Ac/Ds transposon family in heterologous host plants

Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum einen ein neuartiges Aktivierungstagging-System untersucht, bei dem das Ac/Ds-Transposonsystem mit einem System zur regulierten Transkriptionsaktivierung kombiniert wurde. Nach Ac-vermittelter Transposition von Ds, bindet der Transkriptionsaktivator LhG4 an eine Operatorsequenz innerhalb des Ds-Elements und initiiert die Transkription aus dem Ds-Element heraus. Die Transkripte bzw. Proteinprodukte können zu phänotypischen Veränderungen führen, nach denen gescreent werden kann. Die Stärke der Transkriptionsaktivierung kann chemisch durch IPTG reguliert werden. Die Aktivierung der Genexpression mit LhG4 sowie die konzentrationsabhängige Regulation durch IPTG wurden mittels GUS-Reportergenaktivität in Tabakkeimlingen bestätigt. In mehreren Screenings von Tabakkeimlingen, in die alle Komponenten des Aktivierungstagging-Systems eingebracht wurden, konnten morphologisch auffällige Pflanzen detektiert werden. Aus vier Pflanzen, die fusionierte Kotyledonen nach der Keimung aufwiesen, wurden aktivierte Ds-getaggte Transkripte isoliert. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit, die mit dem Ac/Ds-System erschlossen wurde, ist die Markergeneliminierung bei Nutzpflanzen. Hierfür wurden Transformationsvektoren erstellt, die alle Komponenten für die Herstellung von transgenen Pflanzen ohne Markergene enthalten. Bei diesem System wird das Zielgen von den beiden Ds-Enden flankiert. Ein stabiles Ac-Element vermittelt die Transposition der Ds-Zielgen Kassette. Nach erfolgter Exzision wird ein ihp-Element aktiviert, welches über RNAi die Transposaseaktivität silencen kann, um in der Pflanze Sekundärtranspositionen zu verhindern. Durch Integration der Ds-Zielgen-Kassette an einen nicht mit der T-DNA donor site gekoppelten Lokus, kann in der Folgegeneration die T-DNA ausgekreuzt werden. Experimentell wurde in planta gezeigt, dass durch die ihp-Elemente die Ac-Transkriptmenge stark reduziert wird und somit die Sekundärtransposition unterbunden werden sollte.Firstly in this work a novel system for activation tagging was analyzed, which consists of the Ac/Ds transposon system combined with a system for regulated transcription activation. After Ac mediated transposition of Ds, the transcriptional activator LhG4 binds to the operator sequence inside the Ds element and initiates the transcription. The transcripts or the resulting proteins may lead to phenotypical abnormalities, which can be revealed during a mutant screening. The strength of transcription activation can be regulated chemically with IPTG. The activation of gene expression via LhG4 as well as the regulation with IPTG were proven in tobacco seedlings by measuring reporter gene activity. During different screenings of tobacco seedlings, which harbored all components of the activation tagging system, morphological abnormalities were detected. Activated Ds-tagged transcripts were isolated from four plants that showed fused cotyledons. Another application that has been made accessible with the Ac/Ds-System is marker gene elimination in crop plants. For this purpose transformation vectors were generated, which harbor all components for the creation of transgenic plants that do not contain marker genes. In this system two Ds ends flank the gene of interest (goi). A stable Ac element mediates the transposition of this Ds-goi cassette into the plant genome. After the excision took place, an ihp element is activated. This mediates the silencing of the transposase activity by an RNAi mechanism to prevent secondary transposition events in the plant. If the integration of the Ds-goi cassette occurs in a genomic loci that is unlinked to the T-DNA donor site, the T-DNA can be crossed out in the following generation. Experimentally, it was demonstrated in planta that Ac transcription level was drastically reduced through the ihp elements, so that secondary transposition events should be avoided

Alternative splicing of the maize Ac transposase transcript in transgenic sugar beet (Beta vulgaris L.)

The maize Activator/Dissociation (Ac/Ds) transposable element system was introduced into sugar beet. The autonomous Ac and non-autonomous Ds element excise from the T-DNA vector and integrate at novel positions in the sugar beet genome. Ac and Ds excisions generate footprints in the donor T-DNA that support the hairpin model for transposon excision. Two complete integration events into genomic sugar beet DNA were obtained by IPCR. Integration of Ac leads to an eight bp duplication, while integration of Ds in a homologue of a sugar beet flowering locus gene did not induce a duplication. The molecular structure of the target site indicates Ds integration into a double strand break. Analyses of transposase transcription using RT–PCR revealed low amounts of alternatively spliced mRNAs. The fourth intron of the transposase was found to be partially misspliced. Four different splice products were identified. In addition, the second and third exon were found to harbour two and three novel introns, respectively. These utilize each the same splice donor but several alternative splice acceptor sites. Using the SplicePredictor online tool, one of the two introns within exon two is predicted to be efficiently spliced in maize. Most interestingly, splicing of this intron together with the four major introns of Ac would generate a transposase that lacks the DNA binding domain and two of its three nuclear localization signals, but still harbours the dimerization domain