Controlling the size and linkage type of biopolymers derived from sucrose

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A structure-based approach to control the size and linkage-type of sucrose derived alpha-glucans

The demand for bio-derived and biodegradable polymers and oligomers is impressively increasing due to societal and environmental concerns. Among the bio-sourced polymers, the a-glucans produced from sucrose using the glucansucrases from the family 70 of glycoside-hydrolases are quite attractive. They can display various structures, in terms of linkage type, molar mass and polydispersity. Their specific traits directly govern their physico-chemical and biological properties at the source of their potential usage in pharmaceutical, cosmetic or agro-food industries. The accessible molecular diversity is thus large and of interest to extend a-glucan applications. However, the fine control of the structures still suffers from a lack of basic knowledge in the mechanistic and structural determinants at the source of the GH70 enzyme specificity. To fill this gap, we have recently selected different glucansucrases, named DSR-OK, DRS-M and ASR. They synthesize polymers with marked structural differences in terms of size or linkage content. We have solved several 3D structures of these enzymes, unliganded or in complex with different substrates and/or products. The structural analysis of these proteins combined to mutagenesis and biochemical characterization enabled us to identify key determinants of specificity and elaborate mechanistic scenarios for both polymer elongation and linkage type formation. We will first give an overview of the molecular mechanisms involved in polymer formation and will discuss our recent advances with regard to the complexity of the occurring phenomena. We will also show how our findings can rationally serve to construct mutants and chimera leading to a broader range of bioproducts with well-defined structures. Grimaud et al., Green Chemistry, 2018, 20, 4012. Claverie et al., ACS Catalysis, 2017, 7, 7106. Molina et al., ACS Catalysis, 2019, accepte

Enzymatic glycosylation of Ellagic acid

Ellagic acid is a natural biomolecule with several biological propertiesi such as anti-oxidant activity. However the poor solubility of this compound limits its bioavailability and its potential for pharmaceutical or cosmetic application.ii It’s well-known that glycosylation can significantly improve the physicochemical and biological properties of small molecules.iii Enzymatic glycosylation of this compound would be a solution to access a more soluble ellagic acid through a sustainable and environmentally friendly process. Glucansucrases, that use sucrose as donor substrate to transfer a glucose unit, are highly promising catalysts to glycosylate high valuated biomolecules.iv Please click Additional Files below to see the full abstract

Caractérisation structurale et fonctionnelle d'amylosaccharases

Les amylosaccharases sont des a-transglucosylases catalysant naturellement la synthèse exclusive d a-1,4-glucanes à partir du saccharose. Ces enzymes produisent également des composés secondaires et, en particulier, des isomères du saccharose tels que le turanose et le tréhalulose.L objectif de cette thèse a consisté à utiliser un panel de techniques biophysiques et biochimiques afin d étudier les amylosaccharases de Deinococcus geothermalis (ASDg) et Neisseria polysaccharea (ASNp) afin de comprendre les relations unissant la structure, la flexibilité et la fonction de ces enzymes.La première étude rapporte la caractérisation structurale et biophysique de l amylosaccharase la plus thermostable connue à ce jour, l amylosaccharase de Deinococcus geothermalis. La structure tridimensionnelle révèle une organisation dimérique en solution, jamais rapportée pour une amylosaccharase. Grâce à l analyse de l interface dimérique et à des travaux d analyse de séquences, une séquence signature de dimérisation a été identifiée. En rigidifiant la structure de l ASDg, la structure quaternaire contribue à l augmentation de la stabilité thermique de la protéine. La spécificité de production des isomères du saccharose par les amylosaccharases a été étudiée. Les résultats décrivent, pour la première fois, les structures de l ASDg et de l ASNp en complexe avec le turanose. Dans l ASNp, les résidus clefs forcent le résidu fructosyle à adopter une conformation linéaire positionnant idéalement le O3 pour sa glucosylation expliquant la formation préférentielle de turanose par l enzyme. Ces résidus sont absents ou placés différemment dans l ASDg. En conséquence, l ASDg lie principalement les formes furanoses du fructose avec un faible réseau d interactions. La topologie du sous-site +1 permet donc différents modes de liaison du fructose en accord avec la capacité de l ASDg à produire une plus grande quantité de tréhalulose par rapport à l ASNp.Dans la seconde étude, des techniques de mutagenèse à saturation et combinatoire ciblées sur les acides aminés voisins du site actif ont été utilisées pour modifier la spécificité d'accepteur de l ASNp. Le criblage de trois bibliothèques semi-rationnelles représentant un total de 20 000 variants a permis d isoler trois doubles mutants montrant une amélioration spectaculaire de spécificité à la fois vis-à-vis du saccharose, le substrat donneur et de l accepteur a-allyl-N-acetyl-2-désoxy-a-D-glucopyranoside par rapport au type sauvage de l ASNp. De tels niveaux d'amélioration d'activité n'ont jamais été signalés auparavant pour cette classe d enzymes actives sur les sucres. L analyse par cristallographie des rayons X de la structure des meilleures enzymes mutantes suivie par des simulations de dynamique moléculaire ont montré une rigidité locale du sous-site -1 couplée à une flexibilité des boucles impliquées dans la topologie du site actif. Ces faits pourraient être à l origine des performances catalytiques accrues de ces enzymes mutantes. L'étude démontre l'importance, lors de la conception des bibliothèques de variants, de tenir compte de la conformation locale des résidus catalytiques ainsi que de la dynamique des protéines au cours du processus catalytiqueAmylosucrases are sucrose-utilizing a-transglucosylases that naturally catalyze the synthesis of a-glucans, exclusively linked through a-1,4 linkages. Side-products and in particular sucrose isomers such as turanose and trehalulose are also produced by these enzymes.The objective of this thesis concerned the application of biophysical and biochemical techniques to study amylosucrases from Deinococcus geothermalis (DgAS) and Neisseria polysaccharea (NpAS) in order to investigate relationships between structure, flexibility and function of these enzymes.In the first study, we report the first structural and biophysical characterization of the most thermostable amylosucrase identified so far, the amylosucrase from Deinoccocus geothermalis. The 3D-structure revealed a homodimeric quaternary organization, never reported before for other amylosucrases. A sequence signature of dimerization was identified from the analysis of the dimer interface and sequence alignments. By rigidifying DgAS structure, the quaternary organization is likely to participate in the enhanced thermal stability of the protein. Amylosucrase specificity with respect to sucrose isomer formation (turanose or trehalulose) was also investigated. We report the first structures of the DgAS and NpAS in complex with turanose. In NpAS, key residues were found to force the fructosyl moiety to bind in an open state with the O3' ideally positioned to explain the preferential formation of turanose by NpAS. Such residues are either not present or not similarly placed in DgAS. As a consequence, DgAS binds the furanose tautomers of fructose through a weak network of interactions to enable turanose formation. Such topology at subsite +1 is likely favoring other possible fructose binding modes in agreement with the higher amount of trehalulose formed by DgAS.In the second study, iterative saturation mutagenesis and combinatorial active site saturation focused on vicinal amino acids were used to alter the acceptor specificity of NpAS and sort out improved variants. From the screening of three semi-rational sub-libraries accounting in total for 20,000 variants, we report here the isolation of three double-mutants displaying a spectacular specificity enhancement towards both sucrose, the donor substrate, and the a-ally-N-acetyl-2-deoxy-a-D-glucopyranoside acceptor compared to wild-type N. polysaccharea amylosucrase. Such levels of activity improvement have never been reported before for this class of carbohydrate-active enzymes. X-ray structural analysis of the best performing enzymes followed by Molecular Dynamics simulations showed both local rigidity of the -1 subsite and flexibility of loops involved in active site topology which both account for the enhanced catalytic performances of the mutants. The study well illustrates the importance when designing enzyme libraries of taking into account the local conformation of catalytic residues as well as protein dynamics during the catalytic processTOULOUSE-INSA-Bib. electronique (315559905) / SudocSudocFranceF

Activités amylase et lichenase d'une nouvelle souche de Bacillus. Production sur milieu solide et caractérisation.

L objectif de cette thèse était d isoler de nouvelles glycoside-hydrolases à partir d une souche de Bacillus issue d un Biotope sud-tunisien. Cette souche a montré des potentialités à produire une amylase et une lichenase à 45C et à pH 9. La production de ces deux hydrolases a été optimisée en fermentation solide sur millet, une agro-ressource de faible coût. Cette optimisation a été conduite en adoptant la méthodologie des plans d expériences. Nous avons ainsi obtenu des niveaux de production de l ordre de 540 Unités d activités amylase par gramme de substrat solide et 503 U/g d activité lichenase. Ces deux protéines ont été par la suite purifiées et caractérisées biochimiquement. L amylase présente un pH et une température d activité optimaux de 5 et 70C, respectivement. La lichenase a montré une thermoactivité et une thermostabilité remarquables qui la distinguent des lichenases précédemment décrites. En effet, l enzyme conserve plus de 20% de son activité à 100C, et plus de 60% de son activité après une incubation de 30 min à 90C. Le gène codant pour cette protéine a été isolé par la construction d une banque fosmidique dans E. coli. La comparaison de sa séquence avec la banque de données NCBI a montré que le gène de la lichenase UEB-S possède une très forte homologie avec celle de Bacillus subtilis 168, avec les positions de deux acides aminés seulement qui divergent. Un modèle de la lichenase construit au cours de cette étude laisse supposer que l un de ces deux acides aminés (Val 69) pourrait être impliqué dans sa thermostabilité, et ce en modifiant la géométrie du site de fixation au calciumThe aim of this thesis was to isolate new glycoside hydrolases from a Bacillus strain isolated from a Biotope in the south of Tunisia. This strain was able to produce a lichenase and an amylase at 45 C and pH 9. The production of these two hydrolases was optimized in solid state fermentaion using millet, a low cost. agro-resource as solid substrate. This optimization was carried out using response surface methodology (RSM) based on Doehlert design. We obtained production levels of around 540 units of amylase activity per gram of solid substrate and 503 U / g of lichenase activity.Both proteins were subsequently purified and characterized biochemically. The amylase has a pH and a temperature optimum of activity of 5 and 70 C, respectively. The lichenase showed a remarkable thermostability which distinguish it from described lichenases. Indeed, the enzyme retained more than 20% of its activity at 100 C, and more than 60% of its activity after incubation for 30 min at 90 C. The gene encoding this protein was isolated by the construction of genomic a library in E. coli. Comparison of its sequence with the NCBI database showed that the gene coding for UEB-S lichenase has a very high homology with that of Bacillus subtilis 168, with a difference in the position of only two amino acids A model for UEB-S lichenase built during this study suggests that one of these two amino acids (Val 69) could be involved in its thermostability probabely by changing the geometry of the calcium binding siteTOULOUSE-INSA-Bib. electronique (315559905) / SudocSudocFranceF

Ingénierie des glucane-saccharases de la famille 70 des glycoside-hydrolases pour la synthèse de nouveaux biopolymères

Les glucane-saccharases sont des transglucosidases de la famille 70 des glycoside-hydrolases. A partir de saccharose, ces enzymes catalysent la synthèse d alpha -glucanes, polymères de haute masse molaire formés d unités glucosyle. Elles sont aussi capables de synthétiser des oligosaccharides ou glucoconjugués par réaction de transglucosylation sur des accepteurs exogènes de natures variées. De par la diversité de leurs spécificités, tant au niveau des liaisons osidiques synthétisées [alpha (1->2) ; alpha (1->3) ; alpha (1->4) ou alpha (1->6)] que de l organisation de ces liaisons au sein des produits formés, ces biocatalyseurs peuvent être mis à profit pour produire des hydrates de carbones d'intérêt pour les secteurs de l'alimentation, de la santé et de l'environnement. L'objectif de ces travaux de thèse était de générer par ingénierie enzymatique de nouvelles glucane-saccharases capables de synthétiser des alpha -glucanes et des gluco-oligosaccharides de structures et propriétés innovantes, afin d élargir le panel d'applications de ces molécules. Sur le plan fondamental, l'enjeu était aussi d'améliorer la compréhension des relations entre structure et spécificité des glucane-saccharases. Pour atteindre nos objectifs, nous avons utilisé une stratégie d'ingénierie combinatoire de la dextrane-saccharase DSR-S de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F, qui catalyse la synthèse d un dextrane formé à 95 % de liaisons alpha (1->6) et 5 % alpha (1->3). Le travail a tout d'abord consisté à développer une méthode de criblage multi-étapes et à haut-débit, pour isoler et trier les variants de spécificités de liaisons variées. La stratégie comprend une première étape de sélection in vivo sur milieu solide suivie d un criblage par RMN 1D 1H automatisé au format microplaque. Il s'agit de la première méthode de criblage à haut-débit de la spécificité de liaison des transglucosidases et glycosyltransferases. Cette stratégie a ensuite été appliquée au criblage de deux banques de variants de la DSR-S, totalisant plus de 36 000 clones obtenus par mutagénèse de saturation et recombinaison simultanée de 8 résidus du domaine catalytique. Au total, 82 mutants capables de synthétiser entre 2 et 8 fois plus de liaisons alpha (1->3) par rapport à l enzyme parentale ont été isolés. La caractérisation des propriétés catalytiques de sept mutants représentatifs de la diversité de spécificité générée a permis d identifier un nouveau motif peptidique 460DYVHT464 impliqué dans la spécificité de DSR-S. Enfin, la caractérisation de la structure et des propriétés rhéologiques et mécaniques des dextranes synthétisés par ces 7 mutants a mis en évidence les différences de taille et de conformation de ces macromolécules en solution et révélé l aptitude du polymère synthétisé par le variant H463R/T464V/S512T à former des films bio-sourcés innovants, dont les propriétés mécaniques sont remarquables en comparaison de celles d'autres biopolymères extraits de plantes ou produits par fermentationGlucansucrases are transglucosidases from glycoside hydrolase family 70. From sucrose, these enzymes catalyse the synthesis of alpha -glucans, high molecular weight polymers formed of glucosyl units. Glucansucrases are also able to synthesize oligosaccharides or glucoconjugates by transglucosylation reaction onto various exogenous acceptors. Due to the large specificity, in terms of osidic linkages synthesized [alpha (1->2); alpha (1->3); alpha (1->4) or alpha (1->6)] and their organization within the formed products, these biocatalysts can be used to produce carbohydrates of interest in food, health and environment fields. The aim of this research work was to generate, by enzyme engineering, new glucansucrases able to synthesize alpha -glucans and gluco-oligosaccharides with novel structures and properties, to enlarge applications of these molecules. At fundamental level, the work was to improve the understanding of the relationships between structure and specificity of glucansucrases. To reach our objectives, we used a combinatorial engineering strategy on the dextransucrase DSR-S of Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F, which catalyses the synthesis of a dextran formed by 95 % of alpha (1->6) and 5 % alpha (1->3) linkages. The work consisted first in the development of a multi-step high throughput screening methodology to sort out and isolate variants with altered linkage specificities. The strategy includes a first stage of in vivo selection on solid medium followed by an automated 1D 1H NMR-based screening using microplates. To date, this is the first high-throughput screening method for linkage specificity determination of transglucosidases and glycosyltransferases. This strategy was applied to the screening of two DSR-S variants libraries, totalizing more than 36,000 clones obtained by saturation mutagenesis and simultaneous recombination of 8 residues from the catalytic domain. Eighty two mutants able of synthesize 2 to 8 times more alpha (1->3) linkages compared to the parental enzyme were isolated. The characterization of the catalytic properties of 7 representative mutants enabled the identification of a new peptide motif 460DYVHT464, involved in DSR-S specificity. Finally, the characterization of structural, rheological and mechanical properties of dextrans synthetized by these 7 mutants highlighted the differences in size and conformation of these macromolecules in solution and revealed the capacity of the polymer synthesized by H463R/T464V/S512T variant to form biofilms, whose mechanical properties are remarkable in comparison to those of other biopolymers extracted from plants or produced by fermentation.TOULOUSE-INSA-Bib. electronique (315559905) / SudocSudocFranceF

Using Glucan Water Dikinase for in vitro glucan phosphorylation

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Controlling enantioselectivity of limonene synthases by exploring natural diversity combined to molecular engineering

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Synthese enzymatique d'oligosaccharides a l'aide de glucosyltransferases de Leuconostoc mesenteroiedes

CNRS T Bordereau / INIST-CNRS - Institut de l'Information Scientifique et TechniqueSIGLEFRFranc