SK-channel activation alters peripheral metabolic pathways in mice, but not lipopolysaccharide-induced fever or inflammation

PURPOSE: Previously, we have shown that CyPPA (cyclohexyl-[2-(3,5-dimethyl-pyrazol-1-yl)-6-methyl-pyrimidin-4-yl]-amine), a pharmacological small-conductance calcium-activated potassium (SK)–channel positive modulator, antagonizes lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine expression in microglial cells. Here, we aimed to test its therapeutic potential for brain-controlled sickness symptoms, brain inflammatory response during LPS-induced systemic inflammation, and peripheral metabolic pathways in mice. METHODS: Mice were pretreated with CyPPA (15 mg/kg IP) 24 hours before and simultaneously with LPS stimulation (2.5 mg/kg IP), and the sickness response was recorded by a telemetric system for 24 hours. A second cohort of mice were euthanized 2 hours after CyPPA or solvent treatment to assess underlying CyPPA-induced mechanisms. Brain, blood, and liver samples were analyzed for inflammatory mediators or nucleotide concentrations using immunohistochemistry, real-time PCR and Western blot, or HPLC. Moreover, we investigated CyPPA-induced changes of UCP1 expression in brown adipose tissue (BAT)–explant cultures. RESULTS: CyPPA treatment did not affect LPS-induced fever, anorexia, adipsia, or expression profiles of inflammatory mediators in the hypothalamus or plasma or microglial reactivity to LPS (CD11b staining and CD68 mRNA expression). However, CyPPA alone induced a rise in core body temperature linked to heat production via altered metabolic pathways like reduced levels of adenosine, increased protein content, and increased UCP1 expression in BAT-explant cultures, but no alteration in ATP/ADP concentrations in the liver. CyPPA treatment was accompanied by altered pathways, including NFκB signaling, in the hypothalamus and cortex, while circulating cytokines remained unaltered. CONCLUSION: Overall, while CyPPA has promise as a treatment strategy, in particular according to results from in vitro experiments, we did not reveal anti-inflammatory effects during severe LPS-induced systemic inflammation. Interestingly, we found that CyPPA alters metabolic pathways inducing short hyperthermia, most likely due to increased energy turnover in the liver and heat production in BAT

Immunhistochemische, zellbiologische und physiologische in vivo Untersuchungen zum Apelin/APJ-Systemin Hypothalamus und Hypophyse der Ratte

Der Hypothalamus repräsentiert die wichtigste Komponente des Zentralnervensystems (ZNS) zur Integration afferenter Signalinformationen und zur Regulation der Homöostase von Körperkerntemperatur, Wasser- und Elektrolythaushalt des Extrazellularraumes, circadianer Rhythmik sowie Energiehaushalt. Das wichtigste Kerngebiet (Nucleus) des Hypothalamus zur Steuerung der genannten physiologischen Funktionen stellt der in der supraoptischen Region, in unmittelbarer Nähe zum dritten Hirnventrikel gelegene Nucleus paraventricularis (PVN) dar. Der PVN enthält zahlreiche neurosekretorische Zellen und weist darüber hinaus zahlreiche efferente und afferente neuronale Verknüpfungen zu anderen Struktureinheiten des Gehirns auf. Zusätzlich zum PVN kommt auch dem im Bereich der Commissura anterior gelegenen Nucleus praeopticus medianus (MnPO) eine bedeutende, integrative Funktion bei der Regulation des Wasser- und Elektrolythaushaltes sowie der Körperkerntemperatur zu. Bei der Regulation dieser Prozesse spielt neben klassischen und peptidergen Neurotransmittern auch das gasförmige Signalmolekül Stickstoffmonoxid (NO), produziert unter anderem von der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase (nNOS), eine wesentliche neuromodulatorische Rolle. Auch für das apelinerge System, bestehend aus den verschiedenen, aktiven Fragmenten des Preproapelins (Apelin36, Apelin17 und Apelin13) und dem G-Protein gekoppelten Rezeptor APJ, wurde bereits ein zentral vermittelter Einfluss unter anderem auf die Temperaturregulation und auf die Kontrolle des Wasser- und Elektrolythaushaltes beschrieben. Eine Expression sowohl der Apelinpeptide als auch des Rezeptors konnte bisher in peripheren Organen sowie im ZNS, und dabei hauptsächlich im Hypothalamus, gezeigt werden. Trotz zahlreicher Expressionsstudien fehlte jedoch bisher eine detaillierte Kartierung der Verteilung des Rezeptorproteins in Hypothalamus und Thalamus. (1) Anhand der in der vorliegenden Arbeit durchgeführten immunhistochemischen Markierungen an coronalen Gehirnschnitten der Ratte wurde deshalb erstmalig eine detaillierte, semiquantitative Kartierung der Expression des APJ Proteins im Hypothalamus erstellt. Diese Untersuchung bestätigt einerseits die bereits auf mRNA-Ebene publizierte APJ-Expression in Strukturen wie PVN und Nucleus supraopticus (SON), konnte jedoch darüber hinaus in vielen Nuclei und/oder deren Substrukturen wie u.a. dem MnPO, dem medialen Teil des „Bed Nucleus“ der Stria terminalis, dem N. praecommissuralis und dem N. dorsomedialis eine APJ-Expression zum ersten Mal auf Proteinebene für einzelne Neurone bzw. deren Pseudopodia nachweisen. (2) Sowohl für den PVN als auch den MnPO wurde bereits eine Expression von nNOS in früheren Studien beschrieben. Zusätzlich dazu konnte in der Fachliteratur eine Vermittlung apelinerger Effekte über NO etwa anhand der Modulation kardiovaskulärer Parameter in der Peripherie postuliert werden. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit eine mögliche Co-Distribution und -Lokalisation von APJ und nNOS anhand immunhistochemischer Markierungen im Hypothalamus der Ratte untersucht. Dabei konnte u.a. im MnPO eine ausgeprägte Co-Distribution nitrerger Neurone und APJ-immunpositiver Faserstrukturen festgestellt werden. Bei der quantitativen Analyse der Expression von nNOS und APJ in Perikaryen des PVN und des SON hingegen war sogar mit mit ca. 40 % bzw. ca. 50 % markante zelluläre Co-Expression der beiden Moleküle nachweisbar. Aufgrund der ausgeprägten Co-Lokalisation und Co-Distribution in PVN und MnPO könnte somit NO als nachgeschaltetes Signalmolekül auch an der Vermittlung zentraler, apelinerger Wirkmechanismen beteiligt sein. (3) Zur in vitro Untersuchung Apelin-induzierter, intrazellulärer Signaltransduktions-mechanismen wurden aufgrund der ausgeprägten APJ-Rezeptorexpression sowohl MnPO- und PVN-spezifische neurogliale Primärkulturen als auch eine primäre Hypophysenzwischen-lappenkultur (HZL) herangezogen. Änderungen der intrazellulären Calciumkonzentration ([Ca2+]i) als wichtigen second oder third messenger konnten für einzelne Zellen durch den Einsatz calciumbindener Fluorophore wie Fura-2 kontinuierlich erfasst werden (=Calcium-Imaging). Sowohl für Neurone als auch Astrozyten der MnPO- und PVN-spezifischen Kulturen ergab sich bei 2-9 % der Zellen, in PVN-spezifischen Mikrogliazellen hingegen bei 12 % eine direkte Responsivität in Form einer transienten Erhöhung der [Ca2+]i nach Stimulation mit der pyroglutamylierten Form von Apelin13 (PyrAp13) (10-6 mol/l). Wie bereits für andere Neuropeptide beschrieben, vermochte PyrAp13 darüber hinaus den Calciumeinstrom des klassischen Neurotransmitters Glutamat in nitrergen und vor allem nicht-nitrergen Zellen sowohl positiv als auch negativ zu modulieren. Diese modulatorische Wirkung könnte somit möglicherweise die zelluläre Grundlage für physiologische Funktionen des apelinergen Systems als neuer Neuromodulator im ZNS darstellen. Neben der Analyse der [Ca2+]i als dem Apelin13 nachgeschalteten Signal wurde in einigen Publikationen auch über die Involvierung der MAP-Kinasen extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2) im apelinergen Signalweg in peripheren oder transfizierten Zellsystemen berichtet. In der Primärkultur des HZLs mit hoher nativer APJ-Expression konnte in der vorliegenden Arbeit nach apelinerger Stimulation anhand von Western Blot Analysen jedoch keine Aktivierung der ERK1/2 beobachtet werden, möglicherweise bedingt durch eine bereits hohe Phosphorylierung vor der peptidergen Stimulation. (4) Als weiterer wichtiger Aspekt der wissenschaftlichen Arbeit wurden in vivo physiologische Parameter nach intracerebroventrikulärer (i.c.v.) Applikation von PyrAp13 (20 nmol) in der Ratte anhand telemetrischer Datenaufzeichnung untersucht. (A) I.c.v. mikroappliziertes PyrAp13 zeigte dabei keinen signifikanten Einfluss auf durch bakterielles Lipopolysaccharid (LPS, 100 μg/kg Körpergewicht) induzierte Komponenten des sickness behavior wie Anorexie, Adipsie und Lethargie. Jedoch führte es zu einer signifikanten Reduktion des LPS-induzierten Fiebers 3-6 und 6-9 Std. post injectionem und einem signifikanten erniedrigten Plasmaspiegel an Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) als prominenten proinflammatorischen Cytokin 2 Std. nach der Injektion. (B) Trotz der hohen Sequenzähnlichkeit von APJ und dem Angiotensin II (AngII)-Rezeptor und einer in vitro bereits gezeigten Interaktion mit diesem, zeigte i.c.v. mikroappliziertes PyrAp13 jedoch in vivo keinen Einfluss auf durch die zentrale AngII-Applikation induzierte Trinkwasseraufnahme bzw. nukleäre Translokation des neuronalen Aktivitätsmarkers und Transkriptionsfaktors c-Fos. (C) Weiterhin zeigte PyrAp13 i.c.v. selbst beim Vergleich der Injektion vor der Aktivitätsphase mit der Inaktivitätsphase der Versuchstiere keinen Einfluss auf die circadiane Rhythmik telemetrisch erfasster Parameter wie Körpertemperatur, lokomotorische Aktivität und Futter- bzw. Wasseraufnahme

Manifestation of lipopolysaccharide-induced tolerance in neuro-glial primary cultures of the rat afferent somatosensory system

Objective!#!Bacterial lipopolysaccharide (LPS) may contribute to the manifestation of inflammatory pain within structures of the afferent somatosensory system. LPS can induce a state of refractoriness to its own effects termed LPS tolerance. We employed primary neuro-glial cultures from rat dorsal root ganglia (DRG) and the superficial dorsal horn (SDH) of the spinal cord, mainly including the substantia gelatinosa to establish and characterize a model of LPS tolerance within these structures.!##!Methods!#!Tolerance was induced by pre-treatment of both cultures with 1 µg/ml LPS for 18 h, followed by a short-term stimulation with a higher LPS dose (10 µg/ml for 2 h). Cultures treated with solvent were used as controls. Cells from DRG or SDH were investigated by means of RT-PCR (expression of inflammatory genes) and immunocytochemistry (translocation of inflammatory transcription factors into nuclei of cells from both cultures). Supernatants from both cultures were assayed for tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) by highly sensitive bioassays.!##!Results!#!At the mRNA-level, pre-treatment with 1 µg/ml LPS caused reduced expression of TNF-α and enhanced IL-10/TNF-α expression ratios in both cultures upon subsequent stimulation with 10 µg/ml LPS, i.e. LPS tolerance. SDH cultures further showed reduced release of TNF-α into the supernatants and attenuated TNF-α immunoreactivity in microglial cells. In the state of LPS tolerance macrophages from DRG and microglial cells from SDH showed reduced LPS-induced nuclear translocation of the inflammatory transcription factors NFκB and NF-IL6. Nuclear immunoreactivity of the IL-6-activated transcription factor STAT3 was further reduced in neurons from DRG and astrocytes from SDH in LPS tolerant cultures.!##!Conclusion!#!A state of LPS tolerance can be induced in primary cultures from the afferent somatosensory system, which is characterized by a down-regulation of pro-inflammatory mediators. Thus, this model can be applied to study the effects of LPS tolerance at the cellular level, for example possible modifications of neuronal reactivity patterns upon inflammatory stimulation

Primary culture of the rat spinal dorsal horn: a tool to investigate the effects of inflammatory stimulation on the afferent somatosensory system

One maladaptive consequence of inflammatory stimulation of the afferent somatosensory system is the manifestation of inflammatory pain. We established and characterized a neuroglial primary culture of the rat superficial dorsal horn (SDH) of the spinal cord to test responses of this structure to neurochemical, somatosensory, or inflammatory stimulation. Primary cultures of the rat SDH consist of neurons (43%), oligodendrocytes (35%), astrocytes (13%), and microglial cells (9%). Neurons of the SDH responded to cooling (7%), heating (18%), glutamate (80%), substance P (43%), prostaglandin

Sensitization of primary cultures from rat dorsal root ganglia with lipopolysaccharide (LPS) requires a robust inflammatory response

Objective!#!We investigated whether it is possible to induce a state of 'LPS-sensitization' in neurons of primary cultures from rat dorsal root ganglia by pre-treatment with ultra-low doses of LPS.!##!Methods!#!DRG primary cultures were pre-treated with low to ultra-low doses of LPS (0.001-0.1 µg/ml) for 18 h, followed by a short-term stimulation with a higher LPS-dose (10 µg/ml for 2 h). TNF-α in the supernatants was measured as a sensitive read out. Using the fura-2 340/380 nm ratio imaging technique, we further investigated the capsaicin-evoked Ca!##!Results!#!Release of TNF-α evoked by stimulation with 10 µg/ml LPS into the supernatant was not significantly modified by pre-exposure to low to ultra-low LPS-doses. Capsaicin-evoked Ca!##!Conclusion!#!Ultra-low doses of LPS, which per se do not evoke a detectable inflammatory response, are not sufficient to sensitize neurons (C