Systematic site-directed mutagenesis to characterize subunit interactions in E. coli asparaginase II, an enzyme

L-asparaginases (EC 3.5.1.1) catalyze the hydrolysis of L-asparagine to aspartic acid and ammonia. Asparaginases of bacterial origin have been used for over 40 years in the treatment of acute lymphatic leukemia (ALL). Asparaginase isoenzyme II from Escherichia coli (EcA2) is especially effective in cancer therapy. The enzyme, a homotetramer (138 kDa) made up from equivalent dimers, is also an ideal model compound to study folding/unfolding and associa¬tion/dissociation phenomenon of a large oligomeric protein: It is readily amenable to site-directed mutagenesis, a single tryptophan residue per subunit simplifies spectroscopic analysis of conformational changes, and it spontaneously refolds after chemical denaturation. Our aim was to probe the molecular basis of the interactions between the EcA2 dimers by mutations, and to construct EcA2 variants with improved stability for possible application in leukemia treatment. Using guanidine hydrochloride (Gu.HCl) equilibrium denaturation methods, we analyzed unfolding of wild-type EcA2 and a number of variants with amino acid replacements in the interior of the subunits or at the interfaces between the so-called intimate dimers. Enzymatic activity, fluorescence, and CD spectroscopy were used to monitor chemical denaturation by Gu.HCl. For wild-type EcA2 we found a highly cooperative transition from the folded to the denatured state. By gel filtration and sedimentation equilibrium ultracentrifugation, we showed that unfolding of the wild-type enzyme was preceded by dissociation into dimers and monomers. EcA2(WT) showed little change in stability between pH 5-8 but a rapid loss in stability below pH 5. As compared to wild-type enzyme, variants with amino acid exchanges that weaken dimer-dimer interactions exhibited more complex denaturation profiles with one or two stable intermediate states. So, for instance, variants EcA2(Y176S) and EcA2(W66Y/Y181W) dissociate into fully active dimers at low Gu.HCl concentrations. On the other hand, variant EcA2(Y176F) shows higher structural stability and specific activity than the wild-type protein. Thermal unfolding of EcA2 and its mutants was examined by differential scanning calorimetry (DSC) and CD. Correlation of DSC, CD, and light scattering data showed a single cooperative heat unfolding transition accompanied by irreversible protein aggregation, which precluded quantitative thermodynamic analysis of the excess heat capacity data. DSC data of EcA2 (WT) suggested that the increase in protein stability upon an increase in pH from 5-8 is mainly enthalpy-driven. Consistent with the chemical unfolding data, mutant EcA2(Y176F) showed higher thermal stability (a higher melting temperature, Tm) than wild type enzyme while EcA2(Y176S) and EcA2(W66Y/Y181W) were much more heat-sensitive, indicating the preference for large hydrophobic side chains at this site. In addition, two salt bridges, D156•••R191 and D188 •••R195, markedly contribute to the tetramer stability. Our results demonstrate that even small changes at a subunit interface may markedly enhance or impair EcA2 stability without compromising its catalytic properties. Engineered enzyme variants with enhanced stability, such as EcA2(Y176F), are promising candidates for an improved asparaginase therapy of leukemias

Regulation of Pseudomonas putida genes involved in the metabolism of acidic amino acids

Pseudomonas putida KT2440 has the ability to utilize a wide range of amino acids as carbon and nitrogen sources. Rapid growth of this organism is supported by the acidic amino acids (Asp and Glu) and their amides (Asn and Gln) when supplied as sole source of carbon and nitrogen, or in combination with other carbon and nitrogen sources such as glucose and NH4+. A proteomics study based on two-dimensional gel electrophoresis revealed that during growth of P. putida KT2440 in Glu containing medium a set of at least 9 major proteins were up-regulated in a coordinate fashion, whereas 4 other proteins were specifically induced during growth in NH4+/Glucose. Most of the identified proteins have some role in the uptake and utilization of amino acids. Based on their assigned functions genetic organization, we propose that they form a regulon involved in the metabolism of amino acids. By transposon mutagenesis it was found that the expression of that regulon depends on a functional gltB gene which encodes the major subunit of glutamate synthase (GOGAT). Finally, a novel two-component system (aau) was identified which seems to be involved in the utilization of acidic amino acids. Disruption mutants defective in the response regulator (AauR) and the sensor kinase component (AauS), respectively, were constructed and the resulting phenotype analyzed. Growth of both mutants was severely impaired in glutamate and glutamine-containing media. By contrast, both strains grew at normal rates when succinate was supplied in addition to amino acids. This finding indicate that the aau system is related to, but not identical with the dct two-component system which is involved in the utilization of succinate by rhizobia

Functional and biochemical analysis of acidic amino acid transport and utilization by Pseudomonas putida KT2440

The Gram-negative soil bacterium Pseudomonad putida is able to utilize an unusually large number of organic compounds as sources of energy and biomass, among them the acidic amino acids glutamate (Glu) and aspartate (Asp) and their amides glutamine (Gln) and asparagine (Asn). During growth of P. putida on any of these amino acids, the expression of a defined set of genes is induced that allow for their utilization. As reported previously, the Aau two-component system is involved in this adaptation process. In the present study we analyzed the functional role of the AauR-AauS system in the uptake and metabolism of acidic amino acid by P. putida KT2440. Aau-negative mutants were defective in growth Glu and Asp as sole sources of carbon and nitrogen as well as in Glu and Asp uptake. In addition, the AauR mutant failed to express periplasmic glutaminase/ asparaginase (PGA), an enzyme required for the conversion of Gln and Asn to the respective acidic amino acids. Other enzymes involved in the assimilation of Glu and Asp also showed marked changes in activity. AauR deletion mutants grown on Asn and Asp started to accumulate Glu in the late log phase to levels many times higher than in the wild type and also excreted Glu if glucose was available. The excretion of glutamate in these conditions is probably mediated by Bra (a bi-directional ABC transporter), as reported for TCA cycle mutants of other rhizobacteria. The glutamate accumulation by aau mutants may be due to high aspartase activities which feed the carbon skeletons of Asp and Asn into the TCA cycle where glutamate dehydrogenase converts it to glutamate. Immediately upstream of the aau locus of P. putida KT2440, an operon involving genes PP1068-PP1071 encodes an ABC transporter which we named Aat (for acidic amino acid transporter). Aat is also upregulated when P. putida is grown on acidic amino acids or their amides. AatPMQJ is a polar amino acid transporter belonging to the solute-binding protein family (SBP_Bac_3). The Aat system consists of four subunits, where AatP is the nucleotide binding protein, AatM and Aat Q are membrane spanning permeases and AatJ is the periplasmic solute-binding protein. The expressed and purified solute binding protein (AatJ) showed high binding affinity towards Glu and Asp (Kd = 0.4 μM and 1.3 μM respectively), while Gln and Asn as well as other dicarboxylates were bound with much lower affinity. A modeled structure of AatJ (using the glutamine- binding protein GlnH of E. coli as template) suggested a novel arrangement of active site residues which include several arginine residues. The modeled structure was validated by site directed mutagenesis of several AatJ residues predicted to be in contact with the bound ligand. A data base search suggested that AatJ and at least 15 further proteins constitute a new subfamily of periplasmic acidic amino acid receptors. The role of the AauRS two-component system in the transcriptional regulation of aat and the PGA-encoding ansB gene was analyzed by gel-shift assays. The purified recombinant protein AauR was shown to bind to the promoter regions of both aat and ansB. A DNase I footprinting analysis revealed that the AauR binding motif consists of a well-conserved inverted repeat of six nucleotides (GTTCGGNNNNCCGAAC). By in-silico analysis of the P. putida KT2440 genome, several other genes were detected that contain an AauR interaction motif in their promoters. These genes encode a H+/Glu symporter (GltP), phosphoenolpyruvate synthase (PpsA), a branched-chain amino acid transporter (Bra) and a disulphide exchange protein (DsbC). Based on these data, we give an outline of acidic amino acid uptake and metabolism in P. putida and its regulation by the AauRS two-component system

Messung von L-Asparaginase-Antikörper-Titern von pädiatrischen Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie der Nordic Society of Pediatric Hematology and Oncology unter Einsatz eines epitopspezifischen ELISA

L-Asparaginase wird seit mehr als etwa 30 Jahren in der Behandlung der akuten lymphatischen Leukämie sowie einiger Non-Hodgkin-Lymphome im Kindes- und Erwachsenenalter eingesetzt. Die zytotoxische Wirksamkeit des Enzyms beruht auf der Depletion der L-Asparagin-Serumkonzentration durch Hydrolyse der Aminosäure L-Asparagin in L-Asparagin¬säure und Ammoniak. Durch die fehlende Möglichkeit der Tumorzellen ausreichend L-Asparagin zu synthetisieren, kommt es zu einer Beeinträchtigung des Tumorzellstoff-wechsels und schließlich zum Zelluntergang. Aufgrund der bakteriellen Herkunft sind immunologische Reaktionen häufige Neben-wirkungen einer Therapie mit L-Asparaginase. Die Formation von spezifischen Anti-körpern nach Sensibilisierung durch das Protein manifestiert sich klinisch in unter-schiedlicher Ausprägung. Bis zu 30% der Patienten erleiden eine Hypersensitivitäts-reaktion, welche von lokalen Reizerscheinungen bis hin zu einer systemischen Anaphylaxie reicht. Daneben kann es bei einigen Patienten zu einem schnellen Abfall der Enzymaktivität kommen. Infolge der fehlenden klinischen Symptomatik nennt man diesen Vorgang auch „stille Inaktivierung“. Dieses Phänomen übt entscheidenden Ein-fluss auf die Pharmakokinetik des Enzyms und schließlich auf den gesamten Therapie-erfolg aus. Eine Messmethode zur Bestimmung von Antikörpern gegen L-Asparaginase ist bis heute aufgrund der mangelnden Sensitivität und Spezifität in der klinischen Routine nicht eingeführt. Der Einsatz des Gesamtproteins als Antigen in den gegenwärtigen Assays führt zu Kreuzreaktionen, welche eine Aussage über zu erwartende immunologische Reaktionen erheblich einschränken. Drug-Monitoring Pro¬gramme nutzen daher zur Therapiekontrolle die Messung der Enzymaktivität. Zur Verbesserung der Vorhersagegenauigkeit einer klinisch relevanten immunolo-gischen Reaktion wurden Forschungsarbeiten mit dem Ziel der Entwicklung einer epitopspezifischen Messmethode von Antikörpern gegen L-Asparaginase gestartet. Für dieses Projekt wurden in der vorliegenden Arbeit anstatt des Gesamtproteins sechs synthetisch hergestellte Fragmente der L-Asparaginase als Antigene in einem ELISA eingesetzt. Es erfolgte ein Screening auf Antikörper-Bindung unter Verwendung der Seren von 42 pädiatrischen Patienten mit und ohne einer „stillen Inaktivierung“ aus der NOPHO-ALL 2000 Studie, einer multizentrischen ALL-Therapiestudie für Kinder und Jugendliche in den skandinavischen Ländern. Es konnte ein Zusammenhang zwischen der Bindung von Antikörpern an zwei der sechs Peptide und einer „stillen Inaktivierung“ beobachtet werden. Im untersuchten Kollektiv lag für Patienten mit einer raschen Inaktivierung der Enzymaktivität (n=19) am Ende der Reinduktion eine signifikant häufigere Bindung von Antikörpern an das Fragment mit den Aminosäuresequenzen (AS) 1-136 als in der Kontrollgruppe (n=14) vor. Eine häufige, nicht signifikante Bindung konnte an das Fragment mit den AS 214-326 nachgewiesen werden. Ein signifikant höherer Anstieg der Antikörpertiter von der Induktion zur Reinduktion zeigte sich in der Gruppe der „stillen Inaktivierer“ versus der „therapeutischen Aktivität“ für das Fragment mit den AS 1-136 sowie für das L-Asparaginase-Gesamtprotein. Die Sequenzen 1-136 und 214-326 entsprechen dem N- bzw. C-terminalen Anteil des L-Asparaginase-Moleküls und liegen im Bereich des aktiven Zentrums des Enzyms. Eine Bindung von Antikörpern an hier lokalisierten Epitopen führt möglicherweise zu einer Beeinflussung der enzymatischen Aktivität und liefert vermutlich eine Erklärung für den Vorgang der „stillen Inaktivierung“. Patienten mit Enzymaktivität im therapeutischen Bereich (n=23) wiesen nur eine geringe Antikörperbindung auf. Kreuzreaktionen beeinträchtigten auch die Mess-methode des epitopspezifischen Assays. Der Einfluss von Kreuzreaktionen bei der Messung von Antikörpertitern gegen das L-Asparaginase-Gesamtprotein war entgegen der Erfahrung publizierter Arbeiten nur gering. Durch weitere prospektive Studien könnte eine Optimierung des epitopspezifischen Antikörper-Assays und der damit verbundenen Identifikation klinisch relevanter Epitope erreicht werden. Für eine Therapie mit L-Asparaginase bleibt innerhalb eines rationalen Drug-Monitorings die Messung der Enzymaktivität zunächst unersetzlich

Identifizierung klinisch relevante Epitope der E.coli-Asparaginase mit Hilfe synthetischer Peptide

L-Asparaginase ist ein bakterielles Enzym, das erfolgreich in der Behandlung akuter lymphatischer Leukämien sowie einiger maligner Lymphome eingesetzt wird. Das Enzym bewirkt über eine hydrolytische L-Asparagin-Spaltung mit konsekutiver Verminderung der AS-Konzentration im Serum, dass Tumorzellen, welche essentiell auf das Vorhandensein der AS Asparagin angewiesen sind, keine weitere Möglichkeit zur Zellteilung mehr haben. Neben diesem im Rahmen der Chemotherapie erwünschten Effektes kommt es jedoch auch zu ungewollten Nebenwirkungen und Überempfindlichkeiten. Besonders letztere, welche von schweren allergischen Schocks bis hin zu stummer Enzyminaktivierung ohne klinische Zeichen reichen können, stellen medizinisch ein großes Problem dar. Gelänge es, die potentiell für solche Reaktionen prädisponierten Patienten frühzeitig zu erkennen, könnte so eine deutliche Verbesserung des Therapieerfolgs erzielt werden. Die bisher verwendeten immunologischen Nachweistests werden diesem Anspruch jedoch aufgrund zu geringer Sensitivität und Spezifität nicht gerecht. Auf der Annahme basierend, dass es sich bei den gebildeten AK um epitopenspezifische handelt, begannen eine Reihe von Forschungsarbeiten zur genaueren Lokalisation selbiger innerhalb des Enzyms. Als Grundlage diente hierbei unter anderem die mithilfe eines Restriktionsverdaus gewonnene Erkenntnis, dass eine Antikörper-Population bei vorzeitiger Enzyminaktivierung vornehmlich gegen das C-terminale Fragment (237-326) gebildet wird, und die Tatsache, dass auch das Phage Display in etwa zwei Drittel der Fälle eine Identifikation der Sequenz 252-258 zeigte. Das in der vorliegenden Arbeit verwendete SPOTs-Kit (kombinatorische Peptidsynthese auf Zellulose-Membran) zeigte ebenfalls erneut diese dominante Sequenz (SVFDTLA) bei Verwendung von käuflich erworbenem Anti-Asparaginase-Serum, nicht jedoch bei zwei Proben von gesunden Probanden. Unter Berücksichtigung der räumlichen Lage jener Sequenz im Molekül scheint diese tatsächlich eine entscheidende Rolle bei der immunologischen Reaktion der stummen Inaktivierung zu spielen, da die Bindung eines AK an eines der entsprechenden Epitope mit hoher Wahrscheinlichkeit die Bewegung der Enzymschleife und somit die Aktivität blockiert. Die gewonnenen Ergebnisse bestärken die bisher eingeschlagene Forschungsrichtung und liefern weitere Anhaltspunkte in Richtung Entwicklung eines Epitopen-spezifischen Assays. Um statistisch signifikante Aussagen treffen zu können, müsste jedoch an entsprechenden Stichproben weiter untersucht werden

Structure-Activity Relationships of Thiazolyl Resorcinols, Potent and Selective Inhibitors of Human Tyrosinase

Tyrosinase inhibitors are of great clinical interest as agents for the treatment of hyperpigmentary disorders; however, most compounds described in the literature lack clinical efficiency due to insufficient inhibitory activity against human tyrosinase (hTyr). Recently, we reported that thiazolyl resorcinols (4-resorcinylthiazol-2-amines and -amides) are both selective and efficacious inhibitors of hTyr in vitro and in vivo. Here, we measured dose-activity profiles of a large number of thiazolyl resorcinols and analogous compounds to better understand the molecular basis of their interaction with hTyr. We show that both the resorcinyl moiety and the thiazole ring must be intact to allow efficient inhibition of hTyr, while the substituents at the thiazole 2-amino group confer additional inhibitory activity, depending on their size and polarity. The results of molecular docking simulations were in excellent agreement with the experimental data, affording a rationale for the structural importance of either ring. We further propose that a special type of interaction between the thiazole sulfur and a conserved asparagine residue is partially responsible for the superior inhibitory activity of thiazolyl resorcinols against hTyr