Influence of fungal morphology on the performance of industrial fermentation processes for enzyme production

Produktion af industrielle enzymer udføres typisk som vandige aerobe fermenteringer. Filamentøse mikroorganismer er udbredte som værtsorganismer i disse processer pga. adskillige fordele. Samtidig har de store ulemper som følge af den uundgåelige begrænsning i iltoverførselen pga. den høje viskositet af mediet de udvikler, og som menes at være relateret til biomasse koncentrationen, væksthastigheden og morfologien. Den sidste variabel er blandt de mest betydningsfulde egenskaber på grund af sin store kompleksitet, og den er blevet grundigt undersøgt i dette arbejde samt dens korrelation til viskositet og andre procesvariabler. En betydelig mængde forskning er blevet udført igennem årene i forbindelse med svampes morfologi og deres relation til produktivitet. Dog er bidragene i litteraturen kendetegnet ved mangel på relevante industrielle data. En platform er blevet udviklet, som giver anledning til høje enzymproduktiviteter sammenlignet med hvad der tidligere er rapporteret i litteraturen for fed-batch fermentering ved anvendelse af en opløselig inducer (lactose). Forskellige nitrogenkilder er blevet sammenlignet, og det blev konstateret, at sojamel muliggør en højere enzymtiter i sammenligning med hvad der er blevet rapporteret i litteraturen. Den udviklede platform blev anvendt til at undersøge indflydelsen af omrøringsintensiteten på morfologien, rheologien og proteinproduktionsevnen af Trichoderma reesei RUT-C30. Otte fed-batch fermenteringer blev udført i lab-skala fermentorer ved to forskellige mediekoncentrationer og fire forskellige omrøringshastigheder. Morfologien blev målt med laserdiffraktion og den 90. percentil af partikelstørrelsesfordelingen (PSD) blev valgt som den karakteristiske morfologiske parameter. Ingen signifikant forskel i biomassekoncentration, kuldioxidproduktionshastigheden og enzymproduktionen blev observeret som funktion af omrøringshastigheden, selv ved meget høj omrøringseffekt. Imidlertid blev morfologien og rheologien betydeligt påvirket. De indsamlede data blev brugt til at skabe en ny fremgangsmåde til at forudsige filamentøse svampes rheologi, baseret på simple målinger af biomasse og morfologi. Eftersom at morfologi er en vigtig variabel i industrielle vandige fermenteringer, er det vigtigt at forstå de faktorer, der påvirker den. En vigtig faktor er omrøringsinduceret fragmentering, da det vil afgøre størrelsen af partiklerne, som derefter vil påvirke rheologien. En veletableret state-of-the-art funktion, Energy Dissipation Circulation Function (EDCF), er blevet anvendt til at korrelere hyfe fragmentering over et område af reaktorskalaer og omrører typer. Denne korrelation (EDCF) blev dog udviklet til ikke-voksende systemer (off-line fragmentering), og der er ikke foretaget forsøg for at teste dens anvendelse på tværs af forskellige skalaer i egentlige fermenteringsvæsker. For at teste validiteten af denne korrelation, blev et nedskaleringsforsøg udført. En produktionsbatch fra Novozymes A/S, som blev kørt i en produktionsskala bioreaktor (≈ 100 m3) blev skaleret ned til pilotskala (≈1 m3) og lab-skala (≈0.001 m3). EDCF blev beregnet for hvert batch sammen med andre blandingsparametre, og de blev korreleret til den karakteristiske morfologiske parameter, den 90. percentil af PSD. Dataene viste, at andre mere enkle opskaleringsparametre er lige så gode til at forudsige mycelie fragmentering på tværs skalaer. Endvidere blev den morfologiske udvikling af en industriel stamme af T. reesei overvåget i pilotskalafermenteringer fodret med en hidtil ukendt strategi, udviklet i et parallelt projekt. Denne undersøgelse viste, at når morfologien overvåges med laser diffraktion, åbnes muligheden for at studere direkte fysiologiske reaktioner på vækstbetingelser i omrørte bioreaktorer. De opnåede resultater indikerer, at forbrug af næringsstofferne og de resulterende lave koncentrationer af næringsstofferne inducerede fouragering grundet sult, der forårsagede en stigning i hyfe længde. Endelig blev en ny, hurtig og nem metode til statistisk-verificeret kvantificering af den relative hyfe trækstyrke udviklet i den sidste del af dette ph.d.-projekt. Hyfestyrke af svampe er en vigtig fænotype, som kan have en dybtgående indvirkning på bioprocessens adfærd. Anvendeligheden af denne nye metode blev demonstreret ved en estimering af den relative hyfestyrke under vækst i kontrollerede forhold og rapamycin-induceret autophagy for to Aspergillus nidulans stammer. Begge stammer blev dyrket i rystekolber, og den relative hyfe trækstyrke blev sammenlignet. Resultaterne bekræftede anvendeligheden af den udviklede metode i udvælgelse af stamme og procesudvikling. Denne ph.d.-afhandling bringer mere viden til forståelsen af forholdet mellem vækstkinetik, vækstbetingelser og den morfologiske struktur af filamentøse svampe, som kan bidrage med at skræddersy morfologien af en given industriel stamme.Production of industrial enzymes is usually carried out as submerged aerobic fermentations. Filamentous microorganisms are widely used as hosts in these processes due to multiple advantages. Nevertheless, they also present major drawbacks, due to the unavoidable oxygen transfer limitations as a consequence of the high viscosity of the medium that they develop, which is believed to be related to the biomass concentration, growth rate and morphology. This last variable is one of the most outstanding characteristics of the filamentous fungi due to its great complexity and it was extensively studied in this work, along with its correlation to viscosity and other process variables. Considerable research work has been conducted through the years to study fungal morphology and its relation to productivity. However, the work reported in the literature lacks relevant industrial data. In this work, a platform was developed which was able to produce high enzyme titers in comparison with what has been reported thus far in fed-batch fermentation using a soluble inducer (lactose). Different nitrogen sources were compared, and it was found that soy meal allowed for higher enzyme titers compared to what has been reported in the literature. The developed platform was used to study the influence of agitation intensity on the morphology, rheology and protein production capability of Trichoderma reesei RUT-C30. Eight fed-batch fermentations were conducted in bench scale fermenters at two different media concentrations and four different agitation speeds. The morphology was measured with laser diffraction and the 90th percentile of the particle size distribution (PSD) was chosen as the characteristic morphology parameter. No significant difference in biomass concentration, carbon dioxide production rate and enzyme production was observed as a function of agitation speed, even at the very high power inputs. However, the morphology and rheology were considerably affected. The data produced was used to create a novel method to predict filamentous fungi rheology based on simple measurements of biomass and morphology. Thus, morphology is an important variable in industrial submerged fermentation since it highly impacts the broth rheology. Therefore, it is important to understand the factors that affect it. One important factor is agitation-induced fragmentation since it will dictate the size of the particles, which will then affect rheology. A well-established state of the art function, the Energy Dissipation Circulation Function (EDCF), has been used to correlate hyphal fragmentation over a range of scales and impeller types. This correlation was however developed for non-growing systems (off-line fragmentation), and no attempts have been made for testing its application across different scales in actual fermentation broths. Thus, to test the validity of this correlation, a scale-down experiment was carried out. A production batch from Novozymes A/S operated in a production scale bioreactor (≈ 100 m3) was scaled down to pilot scale (≈1 m3) and to bench scale (≈0.001 m3). The EDCF was calculated for each batch along with other mixing parameters and they were correlated to the characteristic morphological parameter, the 90th percentile of the PSD. The data showed that other more simple scale up parameters are equally good at predicting mycelial fragmentation across scales, compared to the EDCF. Furthermore, the morphological development of an industrial strain of T. reesei was monitored in pilot scale fermentations. This study showed that the morphology monitored with laser diffraction also granted the possibility to study direct physiological responses to environmental conditions in stirred bioreactors. The obtained results indicate that the nutrient depletion induced foraging due to starvation, which caused the increase in hyphal length.   Finally, a novel, fast and easy method for statistically-verified quantification of relative hyphal tensile strength was developed in the last part of this PhD project. Fungal hyphal strength is an important phenotype which can have a profound impact on bioprocess behavior. The applicability of this novel method was demonstrated by estimating relative hyphal strength during growth in control conditions and rapamycin-induced autophagy conditions for two strains of Aspergillus nidulans. Both strains were grown in shake flasks, and relative hyphal tensile strength was compared. The findings confirmed the utility of the developed method in strain selection and process development. This PhD thesis brings more knowledge to the understanding of the relationship between growth kinetics, environmental conditions and the morphological structure of the filamentous fungi, which can help to tailor the morphology for a given industrial strain. <br/