Ambiente genético del gen blactx-m-12 en aislamientos hospitalarios de klebsiella pneumoniae

The blaCTX-M-12 gene’s genetic environmnt in Klebsiella pneumoniae hospital isolates Resumen: En Colombia se han detectado genes del grupo CTX-M-1 con alta frecuencia en aislamientos de Klebsiella pneumoniae causantes de infección intrahospitalaria. El conocimiento de los factores genéticos que pueden favorecer la diseminación de estos genes entre especies bacterianas es un aspecto importante para el control de la resistencia. En este estudio se identificaron los plásmidos portadores del gen blaCTX-M-12 en 21 aislamientos clínicos de K. pneumoniae. Se evaluó por conjugación la transferencia de resistencia a antibióticos. Integrones, secuencias de inserción y otros elementos genéticos fueron detectados por amplificación del ADN plasmídico con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Mediante análisis por PCR se determinó la relación entre el gen blaCTX-M-12 y los elementos genéticos detectados. En todos los aislamientos, el gen blaCTX-M-12 se encontró en plásmidos conjugativos de tamaños entre 65 y 106 kpb. La transferencia por conjugación de estos elementos móviles puede explicar la amplia diseminación de este gen entre enterobacterias causantes de infección nosocomial en hospitales de Bogotá, Colombia. El gen blaCTX-M-12 se encontró corriente abajo de ISEcp1, secuencia de inserción que se ha asociado con la movilización de determinantes genéticos de resistencia. Los promotores de ISEcp1, detectados por análisis de secuencia, pueden facilitar la expresión de la cefotaximasa codificada por este gen.Palabras clave: resistencia a antibióticos; elementos genéticos móviles; gen blaCTX-M-12; plásmidos conjugativos;  Klebsiella pneumoniae. Abstract: Genes from CTX-M-1 group have been detected with great frequency in Colombia in intrahospital infection-causing Klebsiella pneumoniae isolates. Knowledge regarding the genetic factors favouring such genes’ dissemination amongst bacterial species is an important issue for resistance control blaCTX-M-12 gene-carrying plasmids were identified in this study in 21 clinical K. pneumoniae isolates. Antibiotic resistance transfer was evaluated by mating. Integrons, insertion sequences and other genetic elements were detected by plasmid DNA amplification using polymerase chain reaction (PCR). The relationship between the blaCTX-M-12 gene and other genetic elements was determined by PCR analysis. The blaCTX-M-12 gene was disemifound on 52 to 106 Kpb conjugative plasmids in all isolates. These mobile elements’ transfer by mating may explain their wide dissemination amongst nosocomial infection-causing enterobacteria in hospitals in Bogota, Colombia. The blaCTX-M-12 gene was found downstream from ISEcp1, this being an insertion sequence which has been associated with resistance genetic determinants’ mobilisation. ISEcp1 promoters (detected by sequence analysis) may increase the expression of cefotaximase encoded by this gene.Key words: antibiotic resistance; mobile genetic element; the blaCTX-M-12 gene;  conjugal plasmid; Klebsiella Pneumoniae

Antibióticos: ¿balas mágicas que ya no dan en el blanco?

Lejano parece el día, a inicios del siglo XX, en que Paul Ehrlich propuso el término de "balas mágicas" como compuestos con toxicidad selectiva capaces de actuar contra microorganismos responsables de infecciones, pero no contra las células eucarióticas del hospedero. Sin lugar a dudas, el hallazgo de la penicilina, la bala mágica por excelencia, es un hito que dio un giro en esencia, los microorganismos tienen mecanismos para hacerse "invisibles" a las balas mágicas o a la terapia utilizada para combatir las enfermedades infecciosas. Para muchos era evidente que el fin de las infecciones bacterianas estaba próximo, sin considerar otros elementos que también tienen un papel importante en la evolución y el desarrollo de la resistencia: la plasticidad de los microorganismos causantes de la infección, y la selección de cepas resistentes por el uso irracional de antibióticos

Modificación del gen lipA codificante de la lipasa de pseudomonas aeruginosa PSA01 dirigida a la alteración de su selectividad hacia ácidos grasos de diferente longitud de cadena

240 páginasLa lipasa LipA de Pseudomonas aeruginosa se caracteriza por hidrolizar un amplio rango de ácidos grasos esterificados en los triacilgliceroles, desde los de 4 carbonos, hasta aquellos con 20 carbonos. En esta investigación se buscó reducir el rango de sustratos de la enzima hacia la hidrólisis de ácidos grasos de longitud de cadena determinados. Las lipasas quimio selectivas son industrialmente interesantes pues favorecen la catálisis de ácidos grasos de longitudes de cadena específicos, en presencia de otros similares en la molécula, promoviendo su enriquecimiento o selección y disminuyendo pasos adicionales de purificación. En LipA se desconoce las estructuras del sitio activo relacionadas con su baja quimio preferencia, siendo necesario su identificación. Se utilizó así la técnica de epPCR para obtener mutantes con selectividad diferencial sobre ácidos grasos. Se establecieron las condiciones de cultivo para la expresión citoplasmática controlada y segura de lipA junto al gen lif codificante de su foldasa, en un constructo no evaluado y en E. coli BL21(DE3) y E. coli SHuffle, en los que la lipasa tiende a precipitarse. Diferencias fueron observadas en la actividad y estabilidad de las enzimas producidas por cada cepa, atribuibles probablemente a la formación del puente disulfuro en SHuffle. Con dinámica molecular se estableció que la ausencia de este enlace altera la estructura y flexibilidad de LipA, explicando dichas diferencias. Para la construcción de las librerías, pelB se fusionó a LipA direccionando su salida al sobrenadante en E. coli Rosetta (DE3) pLysS. Se identificaron 3 variantes en las librerías, una de las cuales, la G10, presentó mayor actividad hacia p-nitrofenil miristato que hacia p-nitrofenil palmitato y mayor hidrólisis hacia los ácidos grasos presentes en el aceite de coco, que los del aceite de oliva.Doctorado en BiocienciasDoctor en Biociencia

Modificación del gen lipA codificante de la lipasa de Pseudomonas aeruginosa PSA01 dirigida a la alteración de su selectividad hacia ácidos grasos de diferente longitud de cadena

240 páginasLipase LipA from Pseudomonas aeruginosa is characterized by hydrolyzing a wide range of esterified fatty acids in triacylglycerols, from those with 4 carbons to those with 20 carbons. In this research, we sought to reduce the enzyme preference towards the hydrolysis of fatty acids of certain chain length. Chemo selective lipases are interesting industrially because they favor the catalysis of fatty acids of specific chain lengths, with other similar ones in the same molecule, promoting their enrichment or selection and reducing additional purification steps. In LipA, the structures of the active site related to its low chemo preference are unknown, and their identification is a must. Thus, a random mutagenesis method with the epPCR technique was used to obtain mutants with differential selectivity for fatty acids. Culture conditions were established for the controlled and safe cytoplasmic expression of lipA together with the lif gene, encoding the foldase essential for its folding, in a construct not previously evaluated for its expression in ELa lipasa LipA de Pseudomonas aeruginosa se caracteriza por hidrolizar un amplio rango de ácidos grasos esterificados en los triacilgliceroles, desde los de 4 carbonos, hasta aquellos con 20 carbonos. En esta investigación se buscó reducir el rango de sustratos de la enzima hacia la hidrólisis de ácidos grasos de longitud de cadena determinados. Las lipasas quimio selectivas son industrialmente interesantes pues favorecen la catálisis de ácidos grasos de longitudes de cadena específicos, en presencia de otros similares en la molécula, promoviendo su enriquecimiento o selección y disminuyendo pasos adicionales de purificación. En LipA se desconoce las estructuras del sitio activo relacionadas con su baja quimio preferencia, siendo necesario su identificación. Se utilizó así la técnica de epPCR para obtener mutantes con selectividad diferencial sobre ácidos grasos. Se establecieron las condiciones de cultivo para la expresión citoplasmática controlada y segura de lipA junto al gen lif codificante de su foldasa, en un constructo no evaluado y en E. coli BL21(DE3) y E. coli SHuffle, en los que la lipasa tiende a precipitarse.Doctorado en BiocienciasDoctor en Biociencia

Antibióticos: ¿Balas mágicas que ya no dan en el blanco?

Lejano parece el día, a inicios del siglo XX, en que Paul Ehrlich propuso el término de "balas mágicas" como compuestos con toxicidad selectiva capaces de actuar contra microorganismos responsables de infecciones, pero no contra las células eucarióticas del hospedero. Sin lugar a dudas, el hallazgo de la penicilina, la bala mágica por excelencia, es un hito que dio un giro en esencia, los microorganismos tienen mecanismos para hacerse "invisibles" a las balas mágicas o a la terapia utilizada para combatir las enfermedades infecciosas. Para muchos era evidente que el fin de las infecciones bacterianas estaba próximo, sin considerar otros elementos que también tienen un papel importante en la evolución y el desarrollo de la resistencia: la plasticidad de los microorganismos causantes de la infección, y la selección de cepas resistentes por el uso irracional de antibióticos

Ambiente genético del Gen blaCTX-M-12 en aislamientos hospitalarios de Klebsiella pneumoniae

The blaCTX-M-12 gene’s genetic environmnt in Klebsiella pneumoniae hospital isolates   Resumen: En Colombia se han detectado genes del grupo CTX-M-1 con alta frecuencia en aislamientos de Klebsiella pneumoniae causantes de infección intrahospitalaria. El conocimiento de los factores genéticos que pueden favorecer la diseminación de estos genes entre especies bacterianas es un aspecto importante para el control de la resistencia. En este estudio se identificaron los plásmidos portadores del gen blaCTX-M-12 en 21 aislamientos clínicos de K. pneumoniae. Se evaluó por conjugación la transferencia de resistencia a antibióticos. Integrones, secuencias de inserción y otros elementos genéticos fueron detectados por amplificación del ADN plasmídico con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Mediante análisis por PCR se determinó la relación entre el gen blaCTX-M-12 y los elementos genéticos detectados. En todos los aislamientos, el gen blaCTX-M-12 se encontró en plásmidos conjugativos de tamaños entre 65 y 106 kpb. La transferencia por conjugación de estos elementos móviles puede explicar la amplia diseminación de este gen entre enterobacterias causantes de infección nosocomial en hospitales de Bogotá, Colombia. El gen blaCTX-M-12 se encontró corriente abajo de ISEcp1, secuencia de inserción que se ha asociado con la movilización de determinantes genéticos de resistencia. Los promotores de ISEcp1, detectados por análisis de secuencia, pueden facilitar la expresión de la cefotaximasa codificada por este gen. Palabras clave: resistencia a antibióticos; elementos genéticos móviles; gen blaCTX-M-12; plásmidos conjugativos;  Klebsiella pneumoniae.   Abstract: Genes from CTX-M-1 group have been detected with great frequency in Colombia in intrahospital infection-causing Klebsiella pneumoniae isolates. Knowledge regarding the genetic factors favouring such genes’ dissemination amongst bacterial species is an important issue for resistance control blaCTX-M-12 gene-carrying plasmids were identified in this study in 21 clinical K. pneumoniae isolates. Antibiotic resistance transfer was evaluated by mating. Integrons, insertion sequences and other genetic elements were detected by plasmid DNA amplification using polymerase chain reaction (PCR). The relationship between the blaCTX-M-12 gene and other genetic elements was determined by PCR analysis. The blaCTX-M-12 gene was disemifound on 52 to 106 Kpb conjugative plasmids in all isolates. These mobile elements’ transfer by mating may explain their wide dissemination amongst nosocomial infection-causing enterobacteria in hospitals in Bogota, Colombia. The blaCTX-M-12 gene was found downstream from ISEcp1, this being an insertion sequence which has been associated with resistance genetic determinants’ mobilisation. ISEcp1 promoters (detected by sequence analysis) may increase the expression of cefotaximase encoded by this gene. Key words: antibiotic resistance; mobile genetic element; the blaCTX-M-12 gene;  conjugal plasmid; Klebsiella Pneumoniae