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In vivo metabolic pathway analysis of Enterococcus faecalis for uncovering key pathogenicity factors
Tese doutoramento em "Chemical and Biological Engineering"In spite of the increasing progress in the fight against prokaryotic pathogens, numerous
bacteria play a significant concern for human health. Most of the current knowledge has
been on isolated biochemical reactions or pathways exposed to a potential stress likely
to be encountered in the host. Enterococci are equipped with a variety of intrinsic (i.e.,
naturally occurring) antibiotic resistances, but are also capable of acquiring new
resistance genes and / or mutations.
The present thesis aimed to gather knowledge on the pathogenic bacterium Enterocccus
faecalis using genomics and post-genomics technologies and continuous culture
techniques to study the behaviour of the complete biological system (bacterial cell) in
vivo under different environmental perturbations.
The knowledge obtained, together with the annotated genome sequence of E. faecalis
was used to develop the first genome-scale mathematical model that will hopefully
serve as a valuable tool to explore the metabolism of the organism and help unravel
hidden metabolic pathways essential for bacterial growth and survival.
The experiments carried out allowed testing two Enterococcus faecalis strains against
the oxidative stress imposed in the form of oxygen and hydrogen peroxide while
varying the dilution rate. The first line defence was observed to be a shift in the
glycolytic pathway, the pentose phosphate pathway and glutathione production while
the downstream response was imposed on the fatty acid metabolism and
demethylmenaquinone biosynthesis.
The first genome-scale reconstruction of this organism involved a pipeline of extremely
laborious tasks that comprised the assembly of all the metabolic reactions encoded on
the annotated genome sequence, the manual curation of the information collected and
the refinement of the network to allow the model to simulate and further test the
capabilities of the network. This model aimed to predict in silico, the capabilities
expressed by this organism in vivo. Indeed, the simulations carried out were able to
accurately predict the qualitative behaviour of this organism evidenced by the metabolic distribution shift observed in the simulations of homolactic and heterolactic metabolism
or under aerobic and anaerobic environment.Apesar do crescente progresso na luta contra agentes patogénicos, são inúmeras as
bactérias que desempenham um papel significativo na saúde humana. O atual
conhecimento tem sido obtido através da análise de reações bioquímicas isoladas ou das
vias expostas a uma condição de estresse passível de ser encontrada no hospedeiro. O
género enterococos está intrinsecamente equipado com uma grande variedade de
resistências a antibióticos, mas é igualmente capaz de adquirir novos genes de
resistência e / ou mutações
A presente tese teve como objetivo explorar o metabolismo do patogénico Enterococcus
faecalis, utilizando para o efeito tecnologias na área da genómica e pós-genómica
acopladas a técnicas de cultura contínua para estudar o comportamento do sistema
biológico completo (célula bacteriana) in vivo sujeito a diferentes perturbações. O
conhecimento obtido, juntamente com o recurso à sequência anotada do genoma da E.
faecalis permitiu desenvolver o primeiro modelo à escala genómica que pretende ser
uma ferramenta valiosa para explorar o metabolismo do organismo e ajudar a revelar
novas vias metabólicas essenciais para o crescimento bacteriano e a sua sobrevivência.
As experiências levadas a cabo com duas estirpes de Enterococcus faecalis analisaram a
resposta metabólica ao estresse oxidativo, aplicada sob a forma de oxigénio e de
peróxido de hidrogénio conjuntamente com uma variação da taxa de diluição.
Observou-se que a primeira linha de defesa em resposta ao estresse foi uma mudança na
via glicolítica, a via das pentoses fosfato e da produção de glutationa, enquanto a
resposta a jusante foi imposta sobre o metabolismo dos ácidos gordos e biossíntese de
demetilmenaquinona.
A reconstrução do primeiro modelo à escala genómica deste organismo envolveu tarefas
laboriosas e complexas num processo iterativo. Todas as reações metabólicas
codificadas na sequência genómica foram recolhidas, seguida da sua curação manual e
posterior refinamento da rede para obter um modelo simulável capaz de testar as
capacidades da rede. Este modelo pretende prever in silico as capacidades expressas in
vivo por este organismo. As simulações realizadas foram capazes de prever com precisão o comportamento qualitativo deste organismo evidenciando uma distribuição
metabólica característica de um metabolismo homolático e heterolático ou em ambiente
aeróbio e anaeróbio