Membrane potential hyperpolarization: A critical factor in acrosomal exocytosis and fertilization in sperm within the female reproductive tract

Hyperpolarization of the membrane potential (Em), a phenomenon regulated by SLO3 channels, stands as a central feature in sperm capacitation-a crucial process conferring upon sperm the ability to fertilize the oocyte. In vitro studies demonstrated that Em hyperpolarization plays a pivotal role in facilitating the mechanisms necessary for the development of hyperactivated motility (HA) and acrosomal exocytosis (AE) occurrence. Nevertheless, the physiological significance of sperm Em within the female reproductive tract remains unexplored. As an approach to this question, we studied sperm migration and AE incidence within the oviduct in the absence of Em hyperpolarization using a novel mouse model established by crossbreeding of SLO3 knock-out (KO) mice with EGFP/DsRed2 mice. Sperm from this model displays impaired HA and AE in vitro. Interestingly, examination of the female reproductive tract shows that SLO3 KO sperm can reach the ampulla, mirroring the quantity of sperm observed in wild-type (WT) counterparts, supporting that the HA needed to reach the fertilization site is not affected. However, a noteworthy distinction emerges-unlike WT sperm, the majority of SLO3 KO sperm arrive at the ampulla with their acrosomes still intact. Of the few SLO3 KO sperm that do manage to reach the oocytes within this location, fertilization does not occur, as indicated by the absence of sperm pronuclei in the MII-oocytes recovered post-mating. In vitro, SLO3 KO sperm fail to penetrate the ZP and fuse with the oocytes. Collectively, these results underscore the vital role of Em hyperpolarization in AE and fertilization within their physiological context, while also revealing that Em is not a prerequisite for the development of the HA motility, essential for sperm migration through the female tract to the ampulla.Fil: Balestrini, Paula Ania. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Sulzyk, Valeria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Jabloñski, Martina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Schiavi Ehrenhaus, Liza Jamaica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Gonzalez, Soledad Natalia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentina. Universidad Nacional de San Martin. Instituto Tecnológico de Chascomús - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto Tecnológico de Chascomús; ArgentinaFil: Ferreira, Juan J.. Washington University in St. Louis; Estados UnidosFil: Gómez Elías, Matías Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Pomata, Pablo Ernesto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Luque, Guillermina Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Krapf, Dario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Cuasnicu, Patricia Sara. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Santi, Celia M.. Washington University in St. Louis; Estados UnidosFil: Buffone, Mariano Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentin

Caracterización y función de las corrientes activadas por hiperpolarización en neuronas piramidales de la lámina V de la corteza prefrontal

En este trabajo se estudiaron las propiedades y las funciones de las corrientesactivadas por hiperpolarización en neuronas piramidales de la lámina V de la cortezaprefrontal utilizando la técnica de "patch-clamp" en configuración célula entera enrebanadas agudas de cerebro. La corriente catiónica activada por la hiperpolarización (Ih) ha sido involucradaen varios roles a nivel celular como el control de la actividad rítmica en célulasmarcapaso cardíacas y neuronas del sistema nervioso central, el mantenimiento del potencial de reposo cerca del umbral de disparo, participación de las propiedades de disparo de potenciales de acción en neuronas sin actividad rítmica, la regulación de la integración sináptica en neuronas piramidales e intervención en algunos tipos de plasticidad sináptica. Las neuronas piramidalesde la lámina V de la corteza cerebral reciben gran cantidad de sinapsis y sonla principal vía de salida de la información hacia regiones subcorticales,por lo que están en una posición privilegiada para ejercer el controlde la información procesada en la corteza cerebral. La corteza prefrontales una región asociada a funciones cognitivas complejas y al control de comportamientos voluntarios motivados. Se cree que está involucrada en enfermedadesneuropsiquiátricas como la esquizofrenia, el déficit de atención con desordenhiperactivo (ADHD), el mal de Parkinson y la adicción a drogas. Se encontró que estas neuronas expresan dos corrientes activadas por hiperpolarización,una lenta (Ih) y una rápida (Ikir, inward rectifier K+ current). Para aislarcada una de estas componentes se utilizó BaCl2, un bloqueante de Ikir, y ZD7288, un bloqueantede Ih. El BaCl2 inhibió Ikir en forma dosis dependiente sin efectosobre Ih hasta 200 uM, con un EC50 de 113,3 +- 2,3 uM. El ZD7288 bloqueó Ihen forma dosis dependiente con un EC50 de 1,65 uM +- 0,6. El estudio de las propiedadesbiofísicas de Ih mostró que cerca del V50 su amplitud fue de 219 +- 16pA y su activacióntuvo dos constantes de tiempo, 169 +- 28 ms y 1306 +- 89 ms. El potencialde reversión y el V50 de Ih fueron -83,6 +- 2,4 mV y -17,6 +- 2,4 mV, respectivamente. Se encontró que Ih en estas neuronas tiene baja sensibilidad a los nucleótidoscíclicos ya que la aplicación de 8Br-cAMP intracelular corrió el V50 de -83,6 +- 2,3 mV a -77,3 +- 3 mV (p = 0,0024). Sin embargo ni dopamina ni serotonina tuvieron efecto sobre Ih en nuestras condiciones. En su conjuntolas características de Ih en neuronas piramidales de la lámina V de corteza prefrontal son similares a las encontradas en hipocampo y corteza somatosensorial deroedores. Estas regiones tienen una alta expresión de la subunidad HCN1 cuyascaracterísticas son similares a las descriptas. En la segunda parte de este trabajo, para entender el rol de Ih en estas neuronas, se estudió el efecto del ZD7288 sobre la excitabilidad y la propagación de potenciales de acción por las dendritas. La aplicación de ZD7288 20 uM produceuna hiperpolarización de 6,9 mV indicando la contribución de Ih al mantenimientodel potencial de reposo. El bloqueo Ih redujo la amplitud de la hiperpolarización post-potencial (AHP) producida luego del disparo en ráfagas en forma dependientedel potencial de reposo. El ZD7288 reduce el AHP a -70mV y -80mV mientras que no tieneefecto a -60mV. Inversamente el AHP a -60mV es inhibido por bloqueantes de la entrada de Ca2+ mientras que a -80 el Ca2+ no contribuye al AHP, indicando que está mediado por Ih. Se estudió si la alta densidad de canales HCN reportada en las dendritas de estas neuronas afecta la propagación de potenciales por la dendrita apical usando un colorante sensible a Ca2+. Se evocaron potenciales de acción somáticos y al mismo tiempo se midió el transitorio de Ca2+ provocado por la apertura de canales de Ca2+ voltaje dependiente en el soma y la región proximal de la dendrita apical. La propagación de potenciales de acción hacia las dendritas provocó un mayor aumento de la entrada de Ca2+ intracelular cuando Ih fue bloqueada con ZD7288 o CsCl en aproximadamente un 20%. Este efecto no fue detectado en el soma. Estos resultados sugieren que Ih participa activamente en el control de la excitabiliad de las neuronas piramidales regulando el patrón de disparo y la propagación retrógrada de potenciales de acción.In the present work we performed whole-cell patch-clamp recordings in acute brainslices in order to elucidate the role and the characteristics of hiperpolarization-activated cationic current (Ih) in layer V pyramidal neurons of mouse frontal cortex. Ih is involved in several functions such as regulation of burst firing in pacemakercells in heart and central neurons, maintainig the resting potential near threshold,contributing to firing patterns in neurons that lack oscillatory firing, control of synaptic integrative properties in pyramidal neurons and regulation of synapticplasticity. Layer V pyramidal neurons receive profuse synaptic input and are the mainoutput to subcortical nucleus. There are a possible point of control of information flow. The prefrontal cortex is a region involved in high order cognitive functions and goal directed behavior. It is involved in pathophysiology of neuropsychiatric disorder like schizophrenia,attentional deficit hyperactive disorder (ADHD) and parkinson disease and drug addiction. Two hyperpolarization-activated currents were identified; an instantaneous componentpresumable the inward rectifier potassium current (Ikir), and a slowlyactivating component, Ih. Extracellular application of BaCl2 blocked Ikir (IC50 = 113.3 +- 2.3 uM) without reducing Ih up to concentrations of 200 uM. ZD7288potently blocked Ih (IC50 1.65 uM +- 0.6). The study of biophysical properties of Ih showed that near V50 the amplitude was -219 +- 16 pA. Activation was well fitted bytwo time constant of 169 +- 28 ms and 1306 +- 89 ms. The V50 and the extrapolated reversal potential of Ih were -83.6 +- 2.4 mV and -17.6 +- 2.4 mV, respectively. The application of intracellular 8Br-cAMP at 10 uM induced a shift in the activation curve from -83.6 +- 2.3 mV a -77.3 +- 3 mV (p = 0.0024). However, neither dopamine nor serotonin were able to modulate the amplitude of Ih in our conditions. Thecharacteristic of Ih in layer V pyramidal neurons of the prefrontal cortex were similarto those described in pyramidal neurons from hippocampus and somatosensory cortex. These regions are rich in the HCN1 subunit whose characteristic are similar to those described here. The selective blocker ZD7288 was used to address the role of Ih in excitabilityand action potential propagation in dendrites. Applications of ZD7288 20 uM at resting potential induced and hiperpolarization of 6.9 mV indicating the involvement inmaintainig resting potential. ZD7288 also reduced the AHP after a train of action potentials. To corroborate this observation we measured the amplitude of the AHP at different resting potentials. The application of ZD7288 20 uM abolished the AHP at 80 mV but had no effect at -60 mV. The perfusion with Ca2+ channel blockers reduced AHP amplitude at -60 mV but had no effect at -80 mV. These results indicate the participation of Ih in the AHP at hyperpolarized potentials. It was shown Ih participates in the regulation of signals transmitted between thesoma and apical dendrites due to the high expression in apical dendrites. To investigatethis phenomenon we performed simultaneous somatic whole-cell recordings and Ca2+imaging in apical dendrites. We found that blockade of Ih with either ZD7288 20 Um or Cs+ 3mM resulted in an increased dendritic Ca2+ transients evoked by trains of somatically evoked action potentials. No effect was detected on somatic Ca2+ levels. These results shows Ih in layer V pyramidal neurons can regulate the firing properties and the backpropagation of action potential.Fil: Pomata, Pablo Ernesto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Reduction of an afterhyperpolarization current increases excitability in striatal cholinergic interneurons in rat parkinsonism

Striatal cholinergic interneurons show tonic spiking activity in the intact and sliced brain, which stems from intrinsic mechanisms. Because of it, they are also known as "tonically active neurons" (TANs). Another hallmark of TAN electrophysiology is a pause response toappetitiveand aversiveeventsandtoenvironmentalcuesthathavepredicted these eventsduringlearning. Notably,thepause response is lost after the degeneration of dopaminergic neurons in animal models of Parkinson's disease. Moreover, Parkinson's disease patients are in a hypercholinergic state and find some clinical benefit in anticholinergic drugs. Current theories propose that excitatory thalamic inputs conveying information about salient sensory stimuli trigger an intrinsic hyperpolarizing response in the striatal cholinergic interneurons. Moreover, it has been postulated that the loss of the pause response in Parkinson's disease is related to a diminution of IsAHP, a slow outward current that mediates an afterhyperpolarization following a train of action potentials. Here we report that IsAHP induces a marked spike-frequency adaptation in adult rat striatal cholinergic interneurons, inducing an abrupt end of firing during sustained excitation. Chronic loss of dopaminergic neurons markedly reduces IsAHP and spike-frequency adaptation in cholinergic interneurons, allowing them to fire continuously and at higher rates during sustained excitation. These findings provide a plausible explanation for the hypercholinergic state in Parkinson's disease. Moreover, areduction ofIsAHPmay alter synchronization ofcholinergic interneurons with afferent inputs, thus contributing to the loss of the pause response in Parkinson's disease.© 2011 the authors.Fil: Sanchez, Gonzalo Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay; ArgentinaFil: Rodriguez, Mariano Julian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay; ArgentinaFil: Pomata, Pablo Ernesto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay; ArgentinaFil: Rela, Lorena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay; ArgentinaFil: Murer, Mario Gustavo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay; Argentin

Striatal NMDA receptors gate cortico-pallidal synchronization in a rat model of Parkinson's disease

Anomalous patterns of synchronization between basal ganglia and cortex underlie the symptoms of Parkinson´s disease. Computational modeling studies suggest that changes in cortical feedback loops involving trans-striatal and trans-subthalamic circuits bring up this anomalous synchronization. We asked whether striatal outflow synchronizes globus pallidus neurons with cortical activity in a rat model of Parkinson´s disease. We found that striatal firing is highly increased in rats with chronic nigrostriatal lesion and that this hyperactivity can be reduced by locally infusing a competitive NMDA receptor antagonist. Moreover, NMDA receptor-dependent striatal output had frequency dependent effects on distinct pathological patterns of cortico-pallidal coupling. Blockade of striatal NMDA receptors almost completely abolished an anomalous ~ 1 Hz cortico-pallidal anti-phase synchronization induced by nigrostriatal degeneration. Moreover, under striatal NMDA receptor blockade, synchronization with 2.5?5 Hz cortical oscillations falls to negligible levels and oscillations at 10?20 Hz are markedly attenuated, whereas beta synchronization (with a peak at ~ 26 Hz) is marginally reduced. Thus, tonic activation of striatal NMDA receptors allows different forms of anomalous oscillations along the cortico-striato-pallidal axis. Moreover, the frequency dependent effects of NMDA receptors suggest that low and high frequency parkinsonian oscillations stem from partially different mechanisms. Finally, our results may help to reconcile views about the contributions of changes in firing rate and oscillatory synchronization to Parkinson´s disease symptoms by showing that they are related to each other.Fil: Zold, Camila Lidia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Ciencias Fisiológicas. Laboratorio de Fisiología de Circuitos Neuronales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Escande, Mariela Veronica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Ciencias Fisiológicas. Laboratorio de Fisiología de Circuitos Neuronales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Pomata, Pablo Ernesto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Ciencias Fisiológicas. Laboratorio de Fisiología de Circuitos Neuronales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Riquelme, Luis A.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Ciencias Fisiológicas. Laboratorio de Fisiología de Circuitos Neuronales; ArgentinaFil: Murer, Mario Gustavo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Ciencias Fisiológicas. Laboratorio de Fisiología de Circuitos Neuronales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Benzodiazepine modulation of homomeric GABAAρ1 receptors: Differential effects of diazepam and 40´-chlorodiazepam

GABAA receptors (GABAARs) are ligand-gated ion channels that mediate inhibitory neurotransmission in the central nervous system (CNS). They are members of the Cys-loop receptor family and display marked structural and functional heterogeneity. Many GABAARs receptor subtypes are allosterically modulated by benzodiazepines (BDZs), which are drugs extensively used as anxiolytics, sedative-hypnotics and anticonvulsants. One high-affinity site and at least three additional low-affinity sites for BDZ recognition have been identified in several heteromeric and homomeric variants of the GABAARs (e.g.: alpha1-beta2-gamma2, alpha1beta2/3, beta3, etc.). However, the modulation of homomeric GABAArhoRs by BDZs was not previously revealed, and these receptors, for a long a time, were assumed to be fully insensitive to the actions of these drugs. In the present study, human homomeric GABAArho1 receptors were expressed in Xenopus oocytes and GABA-evoked responses electrophysiologically recorded in the presence or absence of BDZs. GABAArho1 receptor-mediated responses were modulated by diazepam and 4´-chlorodiazepam in the micromolar range, in a concentration-dependent, voltage-independent and reversible manner. Diazepam produced potentiating effects on GABA-evoked Cl(-) currents and 4´-Cl diazepam induced biphasic effects depending on the GABA concentration, whereas Ro15-4513 and alprazolam were negative modulators. BDZ actions were insensitive to flumazenil. Other BDZs showed negligible activity at equivalent experimental conditions. Our results suggest that GABAArho1 receptor function can be selectively and differentially modulated by BDZs.Fil: Andrea Beltrán González. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular; ArgentinaFil: Pomata, Pablo Ernesto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular; ArgentinaFil: Goutman, Juan Diego. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular; ArgentinaFil: Gasulla, Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular; ArgentinaFil: Chebib, Mary. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular; ArgentinaFil: Calvo, Daniel Juan. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular; Argentin