Administration of vitamin D3 improves antimetastatic efficacy of cancer vaccine therapy of Lewis lung carcinoma

Aim: To analyze antitumor efficacy of experimental cancer vaccine therapy combined with introduction of vitamin D3 (VD3) for treatment of Lewis lung carcinoma (3LL). Materials and Methods: Cancer vaccines composed from recombinant murine beta-defensin-2 (mBD-2) and 3LL cell lysate, or DNA, coding for mBD-2-Muc1 fusion construct cloned in pcDNA3+ vector, were prepared and used for intradermal vaccination. Experimental cancer vaccines introduced i. d. at therapeutic and prophylactic regimens to 3LLbearing C57Bl mice, were applied alone or in combination with VD3 (administered per os) and/or low-dose cyclophosphamide (CP, administered intraperitoneal). Efficacy of treatments was analyzed by primary tumor growth dynamics indexes and by metastasis rate in vaccinated animals. Results: As it has been shown, administration of the protein-based vaccine composed from mBD-2 and 3LL cell lysate in combination with VD3 and CP, but not in VD3 free setting, led to significant suppression of primary tumor growth (p < 0.005) and had significant antimetastatic effect. Introduction of VD3 with or without CP in the scheme of treatment with mBD-2-Muc1-DNA vaccine at therapeutic regimen has led to significant suppression of primary tumor (p < 0.05) and metastasis volumes (p < 0.005), while in the groups of animals treated with DNA-vaccine + VD3 with or without CP at prophylactic regimen, significant antimetastatic effect (p < 0.05) and elevation of average life-span (p < 0.05) have been registered. Conclusion: The results of this pilot study have shown promising clinical effects of VD3 administration in combination with cancer vaccinotherapy in vivo

The ordered disintegration of nuclear DNA as a specific genome reaction accompanying apoptosis, stress response and differentiation

The treatment of agarose embedded nuclear or cellular preparations with protein denaturing agents resulted in ordered cleavage of intact nuclear DNA into high molecular weight fragments with the pattern of fragmentation being unityped for various eukaryotic representatives. We snowed that the set of DNA fragments represents the pre-existing DNA structural domains attributed to the higher levels of chromatin folding, and presented evidence allowing to interpret the nuclear DNA domain organization as a constituent component of topoisomerase III DNA complex with its ability to mediate the cleavage/religation reactions. We demonstrated that changes in the integrity of nuclear DNA, recognizable as an altered pattern of SDS-dependent cleavage of nuclear DNA into high molecular weight DNA fragments, took place at the early stage of apoptosis, upon number of stress challenges and in cells showing various proliferative status. The changes in the integrity of nuclear DNA affected by various influences were shown to be prompt and seem to be of transient nature. The results obtained allow to conclude that changes in the integrity of nuclear DNA revealed as an altered pattern of SDS-dependent high molecular weight DNA cleavage may present the specific genome reaction accompanying the physiological changes in the cells during apoptosis, stress response and differentiation.Уданій роботі показано, що при дії на «заплавлені» в агарозу препарати клітин та ядер білкових денатурантів відбувається упорядковане крупноблочне розщеплення інтактної ядерної ДНК. Фрагменти, що утворюються при цьому, являють собою передіснуючі структурні домени ядерної ДНК, які відповідають виищм рівням упакування хроматину. їх можна розглядати як конститутивний компонент ядерного комплексу ДНК/топоізомераза II, спроможного здійснювати реакцію розщеплення – воз'єднання ДНК Встановлено, що зміна нативності, або цілісності, ядерної ДНК, яка виявляється у зміні характеру DS-Na-золежного крупноблочного розщеплення, ядерної ДНК, відбувається на ранніх етапах апоптозу під дією різноманітних стресових факторів, а також у клітинах з різним рівнем проліферативної активності. Отримані результати дозволяють припустити, що спостережені зміни нативності ядерної ДНК можуть бути специфічною геномною реакцією, яка супроводжує фізіологічні процеси в клітині приаіюптозі, відповіді на стрес або діференціювання.В данной работе показано, что воздействие на препараты «заплавленных» в агарозу клеток или ядер белковых денатурантов приводит к упорядоченному крупноблочному расщеплению интактной ядерной ДНК. Фрагменты, образующиеся при этом, являют собой предсуществующие структурные домены ядерной ДНК, соответствующие высшим уровням упаковки хроматина. Их можно рассматривать как конститутивный компонент ядерного комплекса ДНК/ топоизомераза II, способного осуществлять реакцию расщепления/воссоединения ДНK Установлено, что изменение нативности, или целостности, ядерной ДНК, проявляющееся в изменении характера DS-Na-зависимого крупноблочного расщепления ядерной ДНК, происходит на ранних этапах апоптоза под влиянием всевозможных стрессовых факторов, а также в клетках с различным уровнем пролиферативной активности. Эти изменения происходят быстро и могут иметь обратимый характер. Полученные результаты позволяют предположить, что наблюдаемые изменения нативности ядерной ДНК могут представлять собой специфическую геномную реакцию, сопровождающую физиологические процессы в клетке при апоптозе, ответе на стресс или дифференцировке

Expression of human beta-defensins-1–4 in thyroid cancer cells and new insight on biologic activity of hBD-2 in vitro

The study was aimed on analysis of human beta-defensin-1–4 (hBDs) mRNA expression in cultured thyroid cancer cells and evaluation of effects of recombinant hBD-2 (rec-hBD-2) on growth patterns, migration properties and expression of E-cadherin and vimentin in these cells. Methods: The study was performed on cultured follicular thyroid cancer WRO cells, papillary thyroid cancer TPC1 cells, and anaplastic thyroid cancer KTC-2 cells. For analysis of hBD-1–4 mRNA expression in thyroid cancer cells, semiquantitative RT-PCR was used. Effects of rec-hBD-2 on cell proliferation, viability, and migration were analyzed using direct cell counting, MTT test, and scratch assay respectively. Expression of vimentin and E-cadherin was evaluated by quantitative PCR (qPCR). Results: By the data of RT-PCR, all three studied thyroid cancer cell lines express hBD-1 and -4 mRNA, but not hBD-2 mRNA, while hBD-3 expression was detected in WRO and KTC-2 cells. The treatment of TPC-1, WRO, and KTC-2 cells with 100–1000 nM rec-hBD-2 resulted in significant concentration-dependent suppression of cell proliferation, viability, and migratory property. By the data of qPCR, significant up-regulation of vimentin expression was registered in KTC-2 and WRO cells treated with 500 nM rec-hBD-2. Significant down-regulation of E-cadherin expression (p < 0.05) was detected only in KTC-2 cells treated with the defensin. Also, it has been shown that TPC-1 cells treated with 500 nM rec-hBD-2 acquired more elongated morphology. Conclusion: The data demonstrate that hBD-2 in concentrations higher than 100 nM exerts significant concentration-dependent suppression of thyroid cancer cell growth and migration, and affects vimentin and E-cadherin expression dependent on histologic type of thyroid cancer cells. Key Words: thyroid cancer, human beta-defensin-2, E-cadherin, vimentin, proliferation, viability

Involvement of human beta-defensin-2 in intracellular signaling: in vitro study

Aim: To analyze involvement of human beta-defensin-2 (hBD-2) in intracellular signaling in vitro. Materials and Methods: A431cells were cultured in the presence of 1 µg/ml of recombinant hBD-2 and/or 10 ng/ml EGF. For evaluation of expression of mRNAs for p70S6 kinase, isoforms alpha and beta, RT-PCR analysis was applied. Expression and activity of p70S6K, phosphorylation of PDK1, ERK, JNK, p38 kinases and EGF receptor (EGFR) was evaluated using Western blot analysis. Results: 30 min incubation of A431 cells with 1 µg/ml of hBD-2 didn’t influence autophosphorylation level of EGFR, but resulted in activation of p70S6K, 12 h treatment – in prominently increased level of mRNA for alpha and beta-isoforms of p70S6 kinase, whilst 24 h treatment – in elevation of p70S6K synthesis on protein level. Up-stream kinase phosphorylating p70S6K, PDK1, is also phosporylated upon influence of exogenous hBD-2 in vitro. Conclusion: Our data point on the involvement of PDK1-p70S6K pathway in mediation of action of hBD-2 in A431 cells.Цель: проанализировать участие бета-дефенсина-2 человека (hBD-2) в механизмах передачи внутриклеточных сигналов в модели in vitro. Материалы и методы: клетки линии A431 культивировали в присутствии 1 µг/мл рекомбинантного hBD-2 и/или 10 нг/мл ЭФР. Экспрессию мРНК альфа- и бета-изоформ p70S6 киназы оценивали методом полуколичественного ОТ-ПЦР анализа. Экспрессию и активность p70S6K, фосфорилирование PDK1, ERK, JNK, p38 киназ и рецептора ЭФР (ЭФРР) исследовали методом Вестерн-блот анализа. Результаты: 30 мин инкубация клеток A431 с 1 µг/мл hBD-2 не оказывала влияния на уровень аутофосфорилирования ЭФРР, но препятствовала образованию димеров рецептора в присутствии ЭФР. В то же время 30 мин обработка клеток hBD-2 приводила к активации p70S6K, 12 ч — к значительному повышению уровня мРНК альфа- и бета-изоформ p70S6 киназы, а 24 ч — к повышению синтеза p70S6K на уровне белка. PDK1-киназа, фосфорилирующая p70S6K, также подвергалась фосфорилированию в присутствии экзогенного hBD-2 in vitro. Выводы: данные свидетельствуют об участии каскада PDK1-p70S6K в опосредовании действия hBD-2 в клетках A431

Biologic activities of recombinant human-beta-defensin-4 toward cultured human cancer cells

Aim - the aim of the study was in vitro analysis of biological activity of recombinant human beta-defensin-4 (rec-hBD-4). Methods: hBD-4 cDNA was cloned into pGEX-2T vector, and recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21(DE3) cells. To purify soluble fusion GST-hBD-4 protein, affinity chromatography was applied. Rec-hBD-4 was cleaved from the fusion protein with thrombin, and purified by reverse phase chromatography on Sep-Pack C18. Effects of rec-hBD-4 on proliferation, viability, cell cycle distribution, substrate-independent growth, and mobility of cultured human cancer cells of A431, A549, and TPC-1 lines were analyzed by direct cell counting technique, MTT assay, flow cytofluorometry, colony forming assay in semi-soft medium, and wound healing assay. Rech-BD-4 was expressed in bacterial cells as GST-hBD-4 fusion protein, and purified by routine 3-step procedure (affine chromatography on glutathione-agarose, cleavage of fusion protein by thrombin, and reverse phase chromatography). Analysis of in vitro activity of rec-hBD-4 toward three human cancer cell lines has demonstrated that the defensin is capable to affect cell behaviour in concentration-dependent manner. In 1 - 100 nM concentrations rec-hBD-4 significantly stimulates cancer cell proliferation and viability, and promotes cell cycle progression through G2/M checkpoint, greatly enhances colony-forming activity and mobility of the cells. Treatment of the cells with 500 nM of rec-hBD-4 resulted in opposite effects: significant suppression of cell proliferation and viability, blockage of cell cycle in G1/S checkpoint, significant inhibition of cell migration and colony forming activity

The ordered disintegration of nuclear DNA as a specific genome reaction accompanying apoptosis, stress response and differentiation

The treatment of agarose embedded nuclear or cellular preparations with protein denaturing agents resulted in ordered cleavage of intact nuclear DNA into high molecular weight fragments with the pattern of fragmentation being unityped for various eukaryotic representatives. We snowed that the set of DNA fragments represents the pre-existing DNA structural domains attributed to the higher levels of chromatin folding, and presented evidence allowing to interpret the nuclear DNA domain organization as a constituent component of topoisomerase III DNA complex with its ability to mediate the cleavage/religation reactions. We demonstrated that changes in the integrity of nuclear DNA, recognizable as an altered pattern of SDS-dependent cleavage of nuclear DNA into high molecular weight DNA fragments, took place at the early stage of apoptosis, upon number of stress challenges and in cells showing various proliferative status. The changes in the integrity of nuclear DNA affected by various influences were shown to be prompt and seem to be of transient nature. The results obtained allow to conclude that changes in the integrity of nuclear DNA revealed as an altered pattern of SDS-dependent high molecular weight DNA cleavage may present the specific genome reaction accompanying the physiological changes in the cells during apoptosis, stress response and differentiation.Уданій роботі показано, що при дії на «заплавлені» в агарозу препарати клітин та ядер білкових денатурантів відбувається упорядковане крупноблочне розщеплення інтактної ядерної ДНК. Фрагменти, що утворюються при цьому, являють собою передіснуючі структурні домени ядерної ДНК, які відповідають виищм рівням упакування хроматину. їх можна розглядати як конститутивний компонент ядерного комплексу ДНК/топоізомераза II, спроможного здійснювати реакцію розщеплення – воз'єднання ДНК Встановлено, що зміна нативності, або цілісності, ядерної ДНК, яка виявляється у зміні характеру DS-Na-золежного крупноблочного розщеплення, ядерної ДНК, відбувається на ранніх етапах апоптозу під дією різноманітних стресових факторів, а також у клітинах з різним рівнем проліферативної активності. Отримані результати дозволяють припустити, що спостережені зміни нативності ядерної ДНК можуть бути специфічною геномною реакцією, яка супроводжує фізіологічні процеси в клітині приаіюптозі, відповіді на стрес або діференціювання.В данной работе показано, что воздействие на препараты «заплавленных» в агарозу клеток или ядер белковых денатурантов приводит к упорядоченному крупноблочному расщеплению интактной ядерной ДНК. Фрагменты, образующиеся при этом, являют собой предсуществующие структурные домены ядерной ДНК, соответствующие высшим уровням упаковки хроматина. Их можно рассматривать как конститутивный компонент ядерного комплекса ДНК/ топоизомераза II, способного осуществлять реакцию расщепления/воссоединения ДНK Установлено, что изменение нативности, или целостности, ядерной ДНК, проявляющееся в изменении характера DS-Na-зависимого крупноблочного расщепления ядерной ДНК, происходит на ранних этапах апоптоза под влиянием всевозможных стрессовых факторов, а также в клетках с различным уровнем пролиферативной активности. Эти изменения происходят быстро и могут иметь обратимый характер. Полученные результаты позволяют предположить, что наблюдаемые изменения нативности ядерной ДНК могут представлять собой специфическую геномную реакцию, сопровождающую физиологические процессы в клетке при апоптозе, ответе на стресс или дифференцировке