Valutazione dell'attivita antivirale di un pannello di farmaci nei confronti di SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 è un virus a RNA a polarità positiva appartenente all’ordine Nidovirales e alla famiglia Coronaviridae. È stato isolato in Cina nel gennaio del 2020 e ha causato la pandemia da COVID-19. Si tratta di un virus ad alta patogenicità e trasmissibilità, per questo SARS-CoV-2 è classificato come agente patogeno con un livello di biosicurezza 3 (BSL-3), utilizzabile quindi solo in un laboratorio appositamente attrezzato. Per ovviare a questo problema e studiare la fase di ingresso del virus nella cellula è possibile ricorrere all’uso di vettori lentivirali pseudotipizzati (PLV), che possono essere manipolati anche in BSL-1 e BSL-2. Un PLV è una particella virale che possiede le proteine strutturali di un Lentivirus e la glicoproteina recettoriale S di SARS-CoV-2, avrà la struttura di un Lentivirus ma il tropismo di SARS-CoV-2 e si legherà quindi alla proteina hACE2. Il genoma di un PLV presenta alle estremità due sequenze long terminal repeat (LTR) ma non codifica più nessun gene di HIV, contiene solo una cassetta di espressione per un gene reporter, quindi non è in grado di replicarsi. Lo scopo della tesi è quello di valutare l’attività di un pannello di composti antivirali, sintetizzati dall’Università di Sassari, nei confronti dell’ingresso di SARS-CoV-2. Innanzitutto, è stato ottimizzato un protocollo per la produzione dei vettori pseudotipizzati con la proteina S di SARS-CoV-2 (PLV-S) o con la glicoproteina G del virus della stomatite vescicolare (PLV-VSV-G) da utilizzare come controllo positivo. Per migliorare l’efficienza di trasduzione da parte dei PLV-S sono state trasfettate stabilmente le cellule HEK-293T, con un plasmide codificante per il recettore di SARS-CoV-2, ACE2, ottenendo la linea cellulare HEK-293T/ACE2. Per validare il fatto che i PLV-S riproducessero il meccanismo di entrata del virus SARS-CoV-2, è stato fatto un test di neutralizzazione utilizzando campioni di siero provenienti da pazienti vaccinati contro COVID-19. A questo punto sono stati fatti saggi di citotossicità dei composti sulle cellule HEK-293T/ACE2 e dai risultati ottenuti sono state scelte 2 concentrazioni a cui effettuare il test di tutti i composti (5 µM e 0,5 µM). La valutazione dei composti è stata fatta utilizzando PLV-S con gene reporter luciferasi di lucciola in modo da valutare la loro efficacia tramite un luminometro in termini di unità di luce relativa (RLU). Tra tutti i composti ne sono stati scelti 6 che sembravano inibire l’ingresso dei PLV-S nelle cellule HEK-293T/ACE2 e sono stati ulteriormente testati a diverse concentrazioni (50, 10, 2, 0.4, 0.08 µM) per calcolare la concentrazione inibente il 50% dell’ingresso (IC50). Con i 2 composti più promettenti messi in evidenza da questo ultimo saggio, sono stati effettuati anche dei saggi di riduzione delle placche litiche con i virus CoxsackieB5 e VSV per capire se i composti fossero specifici per SARS-CoV-2 o fossero efficaci anche contro virus diversi. Infine, le cellule HuH7 sono state infettate con SARS-CoV-2 a due concentrazioni di farmaco (50 e 100 µM) e, per vedere l’effetto antivirale dei composti, è stato estratto l’RNA genomico dal surnatante delle cellule infettate per fare una qPCR, il substrato cellulare invece è stato lisato ed è stato effettuato un Western Blot per visualizzare le proteine virali. Come ultima esperimento, sempre con questi due composti, è stato effettuato un saggio del tempo di somministrazione, pre-trattando le cellule con il farmaco o somministrandoo dopo la trasduzione, per capire quale fosse il momento migliore per intervenire inibendo l’infezione

Palmitoylethanolamide (PEA) Inhibits SARS-CoV-2 Entry by Interacting with S Protein and ACE-2 Receptor

Lipids play a crucial role in the entry and egress of viruses, regardless of whether they are naked or enveloped. Recent evidence shows that lipid involvement in viral infection goes much further. During replication, many viruses rearrange internal lipid membranes to create niches where they replicate and assemble. Because of the close connection between lipids and inflammation, the derangement of lipid metabolism also results in the production of inflammatory stimuli. Due to its pivotal function in the viral life cycle, lipid metabolism has become an area of intense research to understand how viruses seize lipids and to design antiviral drugs targeting lipid pathways. Palmitoylethanolamide (PEA) is a lipid-derived peroxisome proliferator-activated receptor-α (PPAR-α) agonist that also counteracts SARS-CoV-2 entry and its replication. Our work highlights for the first time the antiviral potency of PEA against SARS-CoV-2, exerting its activity by two different mechanisms. First, its binding to the SARS-CoV-2 S protein causes a drop in viral infection of ~70%. We show that this activity is specific for SARS-CoV-2, as it does not prevent infection by VSV or HSV-2, other enveloped viruses that use different glycoproteins and entry receptors to mediate their entry. Second, we show that in infected Huh-7 cells, treatment with PEA dismantles lipid droplets, preventing the usage of these vesicular bodies by SARS-CoV-2 as a source of energy and protection against innate cellular defenses. This is not surprising since PEA activates PPAR-α, a transcription factor that, once activated, generates a cascade of events that leads to the disruption of fatty acid droplets, thereby bringing about lipid droplet degradation through β-oxidation. In conclusion, the present work demonstrates a novel mechanism of action for PEA as a direct and indirect antiviral agent against SARS-CoV-2. This evidence reinforces the notion that treatment with this compound might significantly impact the course of COVID-19. Indeed, considering that the protective effects of PEA in COVID-19 are the current objectives of two clinical trials (NCT04619706 and NCT04568876) and given the relative lack of toxicity of PEA in humans, further preclinical and clinical tests will be needed to fully consider PEA as a promising adjuvant therapy in the current COVID-19 pandemic or against emerging RNA viruses that share the same route of replication as coronaviruses