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In silico Studien Viraler Proteine: Struktur, Design, und Dynamik
Viruses still represent a serious health issue today, even in developed countries. Control of virus-related diseases relies on vaccination and/ or medication focussing on specifically interfering with the viral life cycle to minimize adverse effects in the patient. Both, vaccination and medical treatment benefit from detailed knowledge about the structure of viral proteins. Beyond static structural aspects, in many cases a molecular mechanistic understanding of viral protein functions proves crucial. However, atomistic studies of protein structure and dynamics with experimental methods are frequently very difficult. Therefore, computer aided methods represent a powerful supplemental approach, exemplified in the three topics studied in this work. Molecular dynamics (MD) simulations and computational analyses were used to enhance understanding of the correlation between sequence, structure, and dynamics of retroviral proteases and its impact on ligand binding and function. For the identification of the binding sites of neutralizing antibodies directed against human cytomegalovirus (HCMV) structural information was generated by static structure modelling. A dynamic picture of the conformational changes occurring in class III viral fusion proteins was obtained by MD studies of vesicular stomatitis virus glycoprotein G (VSVâG). The two retroviruses human Tâlymphotropic virus type I (HTLVâI) and human immunodeficiency virus type 1 (HIVâ1) are the causative agents of severe and fatal diseases including adult Tâcell leukemia and the acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Both viruses code for a protease that is essential for replication and therefore represents a key drug target. The retroviral proteases of HIVâ1 and HTLVâI share 31% sequence identity and high structural similarities. Yet, their substrate specificities and inhibition profiles differ substantially. In this study, allâatom MD simulations were performed for both enzymes in their ligandâfree state and in complex with model substrates in order to compare their dynamic behaviour. Extensive similarities were found in both local and overall protein dynamics, as well as in the energetics of the interactions with model substrates. Interestingly, those residues important for a strong ligand binding are frequently not conserved in sequence, thereby offering an explanation for the differences in binding specificity. Moreover, an interaction network of contacts between conserved residues was identified that interconnects secondary structure elements and serves as a scaffold for the protein fold. This interaction network is conformationally stable over time and may provide an explanation for the highly similar dynamic behaviour of the two retroviral proteases even in the light of their rather low overall sequence identity. Human cytomegalovirus (HCMV), a member of the herpesvirus family represents a serious health threat for infants and immunocompromised individuals, even in developed countries. Therefore, development of a potent HCMV immunization has been rated top priority by Institute of Medicine of the National Academy of Sciences, USA. In a joint research project with two groups from the Departments of Virology and Molecular Medicine in Erlangen, new neutralizing antibodies directed against the HCMV fusion mediator glycoprotein B (gB) were identified. For their characterization, a set of computational methods was developed in this work to render experimental epitope mapping more efficient. In a first step, structural information about HCMV gB was obtained by modelling the trimeric HCMV gB protein in two alternative conformations. The postfusion model was generated by homology modelling based on the crystal structure of herpes simplex virus (HSV) gB, the prefusion model was created using an alternative modelling approach based on the prefusion structure of vesicular stomatitis virus glycoprotein G (VSVâG). Subsequent engineering of constructs for the isolated expression of discontinuous individual gB domains helped to narrow the binding regions. For epitope fine mapping, candidate residues for a diâalanineâscreening procedure were identified using structural information, such as side chain surface exposition and spatial arrangement, from the previously generated structure models. Where exact epitope required the insertion of multiple alanine mutations, MD simulations were used to assess the conformational stability of the mutant proteins. The usefulness of applying this set of computational methods was demonstrated by the success in mapping the specific epitopes of the majority of tested antibodies. The computer based methods presented in this present study therefore helped to close the gap of knowledge on HCMV gB structural properties and to take the development of HCMV immunization one step further. A third aspect of the present work focused on gaining molecular mechanistic insight into the structural rearrangement of viral fusion proteins involved in the entry process. Herpesviral gB belongs to new class of fusion proteins (class III) which is presently poorly understood. Vesicular stomatitis virus glycoprotein G (VSVâG) also belongs to this class of fusion proteins. Since the structure of VSVâG has been solved in two different conformations, and fusion is known to be triggered by low pH, VSVâG was chosen as a model system to investigate class III fusion mechanisms. To this end, molecular dynamics simulations were performed of the VSVâG prefusion structure in two different protonation states: at physiological pH (pH7) and low pH in the endosome (pH5). Indeed, specific differences in domain motions could be shown for the pH5 system. Domain IV containing the fusion loops, which need to interact with the target membrane, showed distinctly altered conformational sampling compared to the pH7 system. This finding was further supported by energetic analyses revealing weakened interaction between domain IV and the protein core at pH5. Two pairs of structurally neighbouring conserved and differentially protonated residues in the domain IVâcore interface were identified as the likely triggers for domain IV motions. Energetic calculations also demonstrated that the interaction between the subunits of the trimeric VSVâG in strengthened at pH5, mainly due to an increased number of interactions between the Câterminal loop of domain II and the Nâterminus of the adjacent subunit. A pair of interacting residues in this interface that is affected by protonation could be shown to be the main effectors of this phenomenon. The results of the present study thus enhance the mechanistic understanding of the initial steps of pH dependent fusion.Viren stellen auch heute noch eine ernsthafte Gesundheitsbedrohung dar, sogar in den westlichen IndustrielĂ€ndern. Zur Kontrolle von Viruserkrankungen werden Impfâ oder Therapieverfahren eingesetzt, die spezifisch die Funktion viraler Proteine â und damit den Replikationszyklus der Viren â hemmen, um dadurch Nebenwirkungen fĂŒr den Patienten zu minimieren. FĂŒr die Entwicklung von Immunisierungsâ und Behandlungsmethoden ist daher detaillierte Kenntnis der Struktur viraler Proteine von groĂem Vorteil. DarĂŒber hinaus ist hĂ€ufig auch ein molekularâmechanistisches VerstĂ€ndnis viraler Proteinfunktionen unerlĂ€sslich. Die experimentelle Untersuchung von Proteinstrukturen und deren Dynamik auf atomarer Ebene gestaltet sich jedoch mitunter noch Ă€uĂerst schwierig. ComputergestĂŒtzte Methoden stellen daher einen praktikablen und sinnvollen Ansatz dar um diese LĂŒcke zu schlieĂen, wie anhand der drei thematischen Schwerpunkte dieser Arbeit gezeigt wird. MolekĂŒldynamikâSimulationen und in silico Analysen wurden hier genutzt, um das Zusammenspiel zwischen Sequenz, Struktur und Dynamik retroviraler Proteasen und dessen Einfluss auf die Ligandenbindung und Proteinfunktion zu untersuchen. FĂŒr die Bestimmung der Bindungsepitope neutralisierender Antikörper gegen das Humane Cytomegalievirus (HCMV) konnten mithilfe statischer Strukturmodellierung wertvolle Informationen gewonnen werden. DarĂŒber hinaus konnte in MolekĂŒldynamikâStudien von Glykoprotein G des vesikulĂ€ren Stomatitisvirus (VSVâG) ein dynamisches Bild der KonformationsĂ€nderung von Klasse III Fusionsproteinen erhalten werden. Das Humane Tâlymphotrope Virus Typ I (HTLVâI) und das Humane Immundefizienzvirus Typ 1 (HIVâ1) aus der Familie der Retroviren verursachen schwerste und zum Teil tödliche Erkrankungen wie TâZell LeukĂ€mie und das erworbene Immundefizienzsyndrom (AIDS). Beide Viren kodieren in ihrem Genom eine fĂŒr die Replikation essentielle Protease, die eine wichtige Zielstruktur fĂŒr die pharmakologische Therapie darstellt. Die viralen Proteasen von HIVâ1 und HTLVâI sind zu 31% sequenzidentisch und zeigen groĂe strukturelle Ăhnlichkeiten. Allerdings unterscheiden sich ihre SubstratspezifitĂ€ten und Inhibitionsprofile deutlich. In dieser Studie wurden MolekĂŒldynamikâSimulationen beider Enzyme, jeweils im ungebundenen Stadium und im Komplex mit einem Modellsubstrat, durchgefĂŒhrt um ihre dynamischen Eigenschaften zu vergleichen. Dabei wurden erhebliche Ăhnlichkeiten in Bezug auf lokale und globale Dynamik, sowie die Interaktionsenergetik mit den Modellsubstraten festgestellt. Interessanterweise sind die AminosĂ€urereste, die eine starke Interaktion mit dem Substrat vermitteln, zum groĂen Teil nicht konserviert. Diese Beobachtung bietet eine ErklĂ€rung fĂŒr die unterschiedlichen LigandenspezifitĂ€ten der beiden Enzyme. DarĂŒber hinaus wurde ein Interaktionsnetzwerk, bestehend aus Kontakten zwischen konservierten Resten, identifiziert, das SekundĂ€rstrukturelemente miteinander verbindet und als eine Art GerĂŒst fĂŒr die Proteinstruktur dient. Die konformationelle StabilitĂ€t dieses Interaktionsnetzwerks stellt eine mögliche ErklĂ€rung dafĂŒr dar, warum die beiden Proteasen trotz ihrer vergleichsweise geringen SequenzidentitĂ€t in ihren dynamischen Eigenschaften so ausgeprĂ€gte Analogien aufweisen. Das Humane Cytomegalievirus (HCMV), ein Herpesvirus, stellt besonders fĂŒr Neugeborene und ImmungeschwĂ€chte auch in IndustrielĂ€ndern ein schwerwiegendes Gesundheitsrisiko dar. Daher wurde die Entwicklung einer wirksamen Immunisierungsmethode fĂŒr HCMV von der vom Medizinischen Institut der amerikanischen National Academy of Science zur obersten PrioritĂ€t erklĂ€rt. In einem gemeinsamen Forschungsprojekt mit zwei Arbeitsgruppen aus den Instituten fĂŒr Virologie und Molekulare Medizin der UniversitĂ€t Erlangen wurden neue neutralisierende Antikörper gegen das HCMV Membranfusionsprotein Glykoprotein B (HCMV gB) identifiziert. FĂŒr deren Charakterisierung wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit eine Abfolge von in silico Methoden etabliert, um den Prozess der experimentellen EpitopâKartierung effizienter zu gestalten. Im ersten Schritt wurden durch MolekĂŒlmodellierung zwei alternative Konformationen des trimeren gBâProteins generiert, wie sie vor und nach der Membranfusion auftreten (PrĂ€â und PostfusionsâStruktur). Das Modell der Postfusionsâ Konformation wurde auf Grundlage der Kristallstruktur von Herpes Simplex Virus Typ 1 (HSV) gB mithilfe von HomologieâModellierung erstellt. Das PrĂ€fusionsâModell wurde mit einer alternativen Modellierungsmethode basierend auf der PrĂ€fusionsâStruktur von Glykoprotein G des vesikulĂ€ren Stomatitisvirus (VSVâG) generiert. Darauf aufbauend wurden mit Computermethoden Expressionskonstrukte fĂŒr die isolierte Expression einzelner, zum Teil diskontinuierlicher, DomĂ€nen von gB entworfen, mit deren Hilfe die Binderegionen der Antikörper im Experiment eingegrenzt werden konnten. FĂŒr die anschlieĂende Feinkartierung der Epitope wurden Kandidatenreste fĂŒr einen DiâAlaninâScan bestimmt. Aus den vorher erstellten Modellen konnten dafĂŒr strukturelle Daten, wie OberflĂ€chenexposition der Seitenketten und deren relative Lage, genutzt werden. In EinzelfĂ€llen, wo die genaue Bestimmung des Epitops mehrere AlaninâMutationen erforderte, wurde mithilfe von MolekĂŒldynamikâSimulationen die konformationelle StabilitĂ€t der Expressionsmutanten untersucht. Der Nutzen von Computerâbasierten Methoden bei der AntikörperâCharakterisierung wurde dadurch bestĂ€tigt, dass die Epitope der meisten getesteten Antikörper experimentell bestimmt werden konnten. Somit konnte die in dieser Arbeit entwickelte Vorgehensweise dazu beitragen neue Erkenntnisse ĂŒber die strukturellen Eigenschaften von HCMV gB zu gewinnen und die Entwicklung einer HCMVâImmunisierung voranzutreiben. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit ist die molekularâmechanistische Untersuchung des Umlagerungsprozesses viraler Fusionsproteine wĂ€hrend der Verschmelzung von Virusmembran und Zellmembran, die das Eindringen des Virus in die Wirtszelle ermöglicht. Das herpesvirale Glykoprotein B gehört ebenso wie Glykoprotein G des vesikulĂ€ren Stomatitisvirus (VSVâG) zu einer neuen Klasse von Fusionsproteinen (Klasse III), ĂŒber die derzeit noch wenig bekannt ist. Da von VSVâG sowohl die PrĂ€â als auch die PostfusionsâStruktur experimentell bestimmt wurden, und bekannt ist, dass die Umlagerung pHâabhĂ€ngig ist, wurde VSVâG als Modellsystem gewĂ€hlt, um den Fusionsmechanismus von Klasse III Proteinen zu untersuchen. Dazu wurden MolekĂŒldynamikâ Simulationen der PrĂ€fusionsâStruktur von VSVâG in zwei verschiedenen ProtonierungszustĂ€nden durchgefĂŒhrt: bei physiologischem pH7 und bei pH5, entsprechend dem niedrigen endosomalen pH. In den Simulationen zeigten sich bei pH5 spezifische Unterschiede in DomĂ€nenbewegungen von DomĂ€ne IV, in der sich die FusionsâLoops befinden, die mit der Zielmembran interagieren um die Membranfusion zu induzieren. DomĂ€ne IV wies bei niedrigem pH im Vergleich zum pH7âSystem eine deutlich verĂ€nderte Vorzugsorientierung auf. Diese Beobachtung wurde durch energetische Analysen bestĂ€tigt, die eine SchwĂ€chung der Interaktion zwischen DomĂ€ne IV und dem Kernbereich des Proteins erkennen lieĂen. Als wahrscheinliche Ursache fĂŒr diese Unterschiede konnte die differentielle Protonierung von zwei Paaren konservierter interagierender Reste in der entsprechenden ProteinkontaktflĂ€che identifiziert werden. Diese Reste gelten somit als wahrscheinliche Auslöser der pHâinduzierten DomĂ€nenbewegung. DarĂŒber hinaus zeigten energetische Berechungen bei pH5 stĂ€rkere Interaktionsenergien zwischen den einzelnen Untereinheiten des trimeren VSVâG. Dieser Effekt lĂ€sst sich hauptsĂ€chlich auf eine höhere Zahl an molekularen Kontakten zwischen der C-terminalen Schleife von DomĂ€ne II und dem NâTerminus der jeweils angrenzenden Untereinheit zurĂŒckfĂŒhren. Auch in dieser KontaktflĂ€che befindet sich ein Paar interagierender Reste mit differenziell protonierter Seitenkette, das wahrscheinlich maĂgeblich die StĂ€rkung der Trimerâ Interaktionen verursacht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen tragen insgesamt zu einem neuen VerstĂ€ndnis der initialen Schritte der pHâabhĂ€ngigen Fusion in Klasse III Protein bei
B cell repertoire analysis identifies new antigenic domains on glycoprotein B of human cytomegalovirus which are target of neutralizing antibodies.
Human cytomegalovirus (HCMV), a herpesvirus, is a ubiquitously distributed pathogen that causes severe disease in immunosuppressed patients and infected newborns. Efforts are underway to prepare effective subunit vaccines and therapies including antiviral antibodies. However, current vaccine efforts are hampered by the lack of information on protective immune responses against HCMV. Characterizing the B-cell response in healthy infected individuals could aid in the design of optimal vaccines and therapeutic antibodies. To address this problem, we determined, for the first time, the B-cell repertoire against glycoprotein B (gB) of HCMV in different healthy HCMV seropositive individuals in an unbiased fashion. HCMV gB represents a dominant viral antigenic determinant for induction of neutralizing antibodies during infection and is also a component in several experimental HCMV vaccines currently being tested in humans. Our findings have revealed that the vast majority (>90%) of gB-specific antibodies secreted from B-cell clones do not have virus neutralizing activity. Most neutralizing antibodies were found to bind to epitopes not located within the previously characterized antigenic domains (AD) of gB. To map the target structures of these neutralizing antibodies, we generated a 3D model of HCMV gB and used it to identify surface exposed protein domains. Two protein domains were found to be targeted by the majority of neutralizing antibodies. Domain I, located between amino acids (aa) 133-343 of gB and domain II, a discontinuous domain, built from residues 121-132 and 344-438. Analysis of a larger panel of human sera from HCMV seropositive individuals revealed positivity rates of >50% against domain I and >90% against domain II, respectively. In accordance with previous nomenclature the domains were designated AD-4 (Dom II) and AD-5 (Dom I), respectively. Collectively, these data will contribute to optimal vaccine design and development of antibodies effective in passive immunization
Fever and hypothermia represent two populations of sepsis patients and are associated with outside temperature
Background!#!Fever and hypothermia have been observed in septic patients. Their influence on prognosis is subject to ongoing debates.!##!Methods!#!We did a secondary analysis of a large clinical dataset from a quality improvement trial. A binary logistic regression model was calculated to assess the association of the thermal response with outcome and a multinomial regression model to assess factors associated with fever or hypothermia.!##!Results!#!With 6542 analyzable cases we observed a bimodal temperature response characterized by fever or hypothermia, normothermia was rare. Hypothermia and high fever were both associated with higher lactate values. Hypothermia was associated with higher mortality, but this association was reduced after adjustment for other risk factors. Age, community-acquired sepsis, lower BMI and lower outside temperatures were associated with hypothermia while bacteremia and higher procalcitonin values were associated with high fever.!##!Conclusions!#!Septic patients show either a hypothermic or a fever response. Whether hypothermia is a maladaptive response, as indicated by the higher mortality in hypothermic patients, or an adaptive response in patients with limited metabolic reserves under colder environmental conditions, remains an open question. Trial registration The original trial whose dataset was analyzed was registered at ClinicalTrials.gov (NCT01187134) on August 23, 2010, the first patient was included on July 1, 2011