Développement de nouveaux outils analytiques à base d'acides nucléiques aptamères pour la détection de petites molécules

La détection de petites molécules est d'un grand intérêt dans les domaines pharmaceutique, environnemental, alimentaire et de la biologie clinique. Les aptamères, sélectionnés par la méthode SELEX (pour Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), sont des oligonucléotides qui se lient à une cible donnée avec une affinité et une spécificité importantes. L'objectif de ce travail est d'établir de nouvelles méthodologies analytiques basées sur l'utilisation des aptamères pour la détection de petites molécules. Dans un premier temps, une méthodologie par électrophorèse capillaire, dérivée du concept de déplacement du brin complémentaire de l'aptamère, est décrite pour la détection simultanée de plusieurs analytes dans un seul capillaire. La deuxième étude se focalise sur le développement d'un aptacapteur colorimétrique simple, rapide et peu coûteux, qui utilise le concept général de protection enzymatique de l'aptamère et les nanoparticules d'or en tant que système de transduction. Enfin, deux méthodes par polarisation de fluorescence, basées sur le concept de déplacement (du brin complémentaire ou de l'aptamère lui-même), sont présentées afin d'accroitre les potentialités des aptacapteurs dédiés à la détection des petites molécules.Small biomolecule detection is of great interest and importance in the pharmaceutical, environmental, food and clinical fields. Aptamers, selected by SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), are oligonucleotides that bind to a target with high affinity and specificity. The objective of the work is to establish novel methodologies of aptamer-based assays for the small biomolecule detection. In the first work, a rationalized capillary electrophoresis strategy, derived from the structure-switching aptamer concept, is described for the design of simultaneous detection of multiple analytes. The second work based on a gold nanoparticle colorimetric sensing strategy allows a rapid, label-free, homogeneous assay for small molecule using an aptamer enzymatic cleavage protection strategy. In the third work, two aptamer-based fluorescence polarization approaches, using the displacement concept, are described to improve the potentialities of the small molecule-dedicated aptasensors.SAVOIE-SCD - Bib.électronique (730659901) / SudocGRENOBLE1/INP-Bib.électronique (384210012) / SudocGRENOBLE2/3-Bib.électronique (384219901) / SudocSudocFranceF

Non-SELEX isolation of DNA aptamers for the homogeneous-phase fluorescence anisotropy sensing of tau Proteins

International audienc

Inside the Hypercube

Bernstein\u27s CubeHash is a hash function family that includes four functions submitted to the NIST Hash Competition. A CubeHash function is parametrized by a number of rounds r, a block byte size b, and a digest bit length h (the compression function makes r rounds, while the finalization function makes 10r rounds). The 1024-bit internal state of CubeHash is represented as a five-dimensional hypercube. The submissions to NIST recommends r=8, b=1, and h in {224,256,384,512}. This paper presents the first external analysis of CubeHash, with: improved standard generic attacks for collisions and preimages; a multicollision attack that exploits fixed points; a study of the round function symmetries; a preimage attack that exploits these symmetries; a practical collision attack on a weakened version of CubeHash; a study of fixed points and an example of nontrivial fixed point; high-probability truncated differentials over 10 rounds. Since the first publication of these results, several collision attacks for reduced versions of CubeHash were published by Dai, Peyrin, et al. Our results are more general, since they apply to any choice of the parameters, and show intrinsic properties of the CubeHash design, rather than attacks on specific versions

Aptamers in Bordeaux, 24−25 June 2016

The symposium covered the many different aspects of the selection and the characterization of aptamers as well as their application in analytical, diagnostic and therapeutic areas. Natural and artificial riboswitches were discussed. Recent advances for the design of mutated polymerases and of chemically modified nucleic acid bases that provide aptamers with new properties were presented. The power of aptamer platforms for multiplex analysis of biomarkers of major human diseases was described. The potential of aptamers for the treatment of cancer or cardiovascular diseases was also presented. Brief summaries of the lectures presented during the symposium are given in this report. A second edition of “Aptamers in Bordeaux” will take place on September 2017 (http://www.aptamers-in-bordeaux.com/)

Surgical rates for Crohn’s Disease are decreasing: a population-based time trend analysis and validation study

Objectives: Temporal changes for intestinal resections for Crohn’s disease (CD) are controversial. We validated administrative database codes for CD diagnosis and surgery in hospitalized patients and then evaluated temporal trends in CD surgical resection rates. Methods: First, we validated International Classification of Disease (ICD)-10-CM coding for CD diagnosis in hospitalized patients and Canadian Classification of Health Intervention coding for surgical resections. Second, we used these validated codes to conduct population-based surveillance between fiscal years 2002 and 2010 to identify adult CD patients undergoing intestinal resection (n=981). Annual surgical rate was calculated by dividing incident surgeries by estimated CD prevalence. Time trend analysis was performed and annual percent change (APC) with 95% confidence intervals (CI) in surgical resection rates were calculated using a generalized linear model assuming a Poisson distribution. Results: In the validation cohort, 101/104 (97.1%) patients undergoing surgery and 191/200 (95.5%) patients admitted without surgery were confirmed to have CD on chart review. Among the 116 administrative database codes for surgical resection, 97.4% were confirmed intestinal resections on chart review. From 2002 to 2010, the overall CD surgical resection rate was 3.8 resections per 100 person-years. During the study period, rate of surgery decreased by 3.5% per year (95% CI: -1.1%, -5.8%), driven by decreasing emergent operations (-10.1% per year [95% CI: -13.4%, -6.7%]) whereas elective surgeries increased by 3.7% per year (95% CI: 0.1%, 7.3%). Conclusions: Overall surgical resection rates in CD are decreasing, but a paradigm shift has occurred whereby elective operations are now more commonly performed than emergent surgeries

cis-Urocanic Acid Attenuates Acute Dextran Sodium Sulphate-Induced Intestinal Inflammation

On exposure to sunlight, urocanic acid (UCA) in the skin is converted from trans to the cis form and distributed systemically where it confers systemic immunosuppression. The aim of this study was to determine if administration of cis-UCA would be effective in attenuating colitis and the possible role of IL-10. Colitis was induced in 129/SvEv mice by administering 5% dextran sodium sulfate (DSS) for 7 days in drinking water. During this period mice received daily subcutaneously injections of cis-UCA or vehicle. To examine a role for IL-10, 129/SvEv IL-10−/− mice were injected for 24 days with cis-UCA or vehicle. Clinical disease was assessed by measurement of body weight, stool consistency, and presence of blood. At sacrifice, colonic tissue was collected for histology and measurement of myeloperoxidase and cytokines. Splenocytes were analyzed for CD4+CD25+FoxP3+ T-regulatory cells via flow cytometry. Murine bone-marrow derived antigen-presenting cells were treated with lipopolysaccharide (LPS) ± UCA and cytokine secretion measured. Our results demonstrated that cis-UCA at a dose of 50 µg was effective in ameliorating DSS-induced colitis as evidenced by reduced weight loss and attenuated changes in colon weight/length. This protection was associated with reduced colonic expression of CXCL1, an increased expression of IL-17A and a significant preservation of splenic CD4+CD25+FoxP3+ T-regulatory cells. cis-UCA decreased LPS induced CXCL1, but not TNFα secretion, from antigen-presenting cells in vitro. UCA reduced colonic levels of IFNγ in IL-10−/− mice but did not attenuate colitis. In conclusion, this study demonstrates that cis-urocanic acid is effective in reducing the severity of colitis in a chemically-induced mouse model, indicating that pathways induced by ultraviolet radiation to the skin can influence distal sites of inflammation. This provides further evidence for a possible role for sunlight exposure in modulating inflammatory disorders

Aptamères énantiosélectifs en série ADN et ARN : applications à la séparation chirale en micro-chromatographie et en électrophorèse capillaire (EC)

La séparation d'énantiomères est d'un grand intérêt pour les industries pharmaceutiques, chimiques et agroalimentaires. Les aptamères sont utilisés au sein du Département de Pharmacochimie Moléculaire (DPM) en tant que nouveaux sélecteurs chiraux spécifiques d'une cible prédéterminée. Il s'agit d'oligonucléotides, en série ADN et ARN, générés par la procédure SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), ayant la capacité à fixer leurs molécules cibles avec une affinité égale voir supérieure à celle des anticorps. Ce travail a pour objectif d'étudier les propriétés énantiosélectives des aptamères, en série ADN et ARN, par micro-CLHP et EC. Une phase stationnaire chirale aptamère L-ARN anti-D-histidine a été créée en utilisant une stratégie d'immobilisation biotine-streptavidine dans le but d'étudier les propriétés énantiosélectives de cet oligonucléotide récemment isolé. Une nouvelle stratégie d'immobilisation covalente de l'aptamère a été développée afin d'élargir les conditions d'utilisation et d'améliorer la stabilité de ces colonnes aptamères. L'utilisation de ces nouveaux sélecteurs chiraux a ensuite été étendue à une analyse par EC. La première étude a été réalisée sur un aptamère test L-ARN anti-D-arginine caractérisé par de très fortes affinité (Kd = 330 nM) et énantiosélectivité (a = 12000). Ce travail a permis d'apprécier les caractéristiques exceptionnelles de cet aptamère et d'envisager son utilisation dans un essai énantiosélectif par compétition. Une impureté énantiomérique de 0,01% a ainsi été détectée. Un essai similaire, où un contact direct entre l'aptamère et son énantiomère cible est favorisé, a permis d'augmenter la sensibilité de la méthode et pourrait permettre d'abaisser la limite de détection grâce à l'utilisation d'une détection par fluorescence.The separation of enantiomers is of a great interest in the pharmaceutical, chemical and food fields. Aptamers have been used by the Department of Molecular Pharmacochemistry (DPM) as new target-specific chiral selectors. These oligonucleotides, RNA or DNA, selected by SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), have the ability to bind their target molecules with an affinity equal (or superior) to that retrieved with the antibodies. The aim of this work is to study the enantioselective properties of RNA and DNA aptamers by micro-HPLC and CE. A chiral stationary phase L-RNA aptamer anti-D-histidine was designed using an immobilization strategy based on the biotin-streptavidin link. A novel covalent strategy for the immobilization of the aptamers was developed to enlarge the conditions of use and to improve the stability of these aptamers columns. The use of these new chiral selectors was then spread in an analysis by CE. The first study was accomplished using an L-RNA aptamer anti-D-arginine characterized by a very weak constant of dissociation (Kd = 330 nM) and a very high enantioselectivity (a = 12000). This study allowed to appreciate the special characteristics of this aptamer and to extend its use in an enantioselective competitive assay. An enantiomeric impurity as low as 0,01% was achieved. A similar assay, where a direct contact between the aptamer and its enantiomer target is favoured, allowed to increase the method sensitivity and could allow to reduce the detection limit thanks to the use of a fluorescence detection.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Phases stationnaires chirales à base de teicoplanine et d'aminoglycosides pour la séparation d'énantiomères d'acides aminés

Les acides aminés sont des éléments chiraux essentiels de la vie, ils ont des effets biologiques et pharmacologiques très importants. La séparation chirale des énantiomères des acides aminés est indispensable dans de nombreux domaines tels que l'industrie pharmaceutique, l'agroalimentaire, l'archéologie et la médecine légale. La chromatographie liquide haute performance (CLHP) avec l'utilisation d'une phase stationnaire chirale constitue à l'heure actuelle la méthode de choix pour séparer des énantiomères. Ce travail a permis d'étudier les mécanismes d'interactions mis en jeu dans la fixation et la séparation des énantiomères du tryptophane sur des phases stationnaires chirales (PSCs) de type teicoplanine et teicoplanine aglycone (TAG). Une étude thermodynamique comparative entre ces deux PSCs a permis de déterminer le rôle négatif joué par les trois unités saccharidiques de la teicoplanine dans le processus de discrimination chirale du tryptophane. Ainsi, nous avons montré que cet acide aminé interagit considérablement avec la poche aglycone de la teicoplanine. L'utilisation d'une nouvelle PSC de type teicoplanine, immobilisée de manière non-covalente sur des supports chromatographiques de type C8 et C18, a permis de séparer quelques acides aminés aromatiques et d'inverser leur ordre d'élution énantiomérique (L>D) par rapport à celui classiquement obtenu avec une immobilisation covalente sur gel de silice (D>L). Par ailleurs, nous avons développé une nouvelle classe de sélecteurs chiraux à base d'aminoglycosides en chromatographie chirale d'échange de ligands. Plusieurs énantiomères d'acides aminés et de nucléosides ont été séparés avec succès sur ce nouveau type de PSCsAmino acids are essential chiral elements of life, they have very important biological and pharmacological effects. The separation of amino acids enantiomers is of a crucial importance in various fields such as pharmaceutical industry, agroalimentary, archaeology and forensic sciences. The high performance liquid chromatography (HPLC) using a chiral stationary phase represents at present time the method of choice to separate enantiomers. This work has analyzed the interaction mechanisms involved in the fixation and in the enantioselective separation of tryptophan enantiomers on teicoplanin and teicoplanin aglycone (TAG) chiral stationary phases (CSPs). A comparative thermodynamic study between these two CSPs was performed to investigate the negative role played by the three saccharidic units of the teicoplanin in the chiral discrimination process. Thus, we showed that tryptophan interacts considerably with the aglycone pocket of the teicoplanin. A simple coating method of reversed-phase supports to prepare a new teicoplanin CSP has allowed to separate some aromatic amino acids and to reverse their enantiomeric elution order (L>D) compared to that classically obtained with a teicoplanin covalently immobilized on silica support (D>L). In addition, we have developed a new class of chiral selectors based on aminoglycosides for chiral ligand-exchange chromatography. Several enantiomers of amino acids and nucleosides were separate successfully on this new kind of CSPsGRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Les métaux lourds dans certaines denrées alimentaires (état des lieux et évolution des méthodes analytiques (arsenic et mercure))

Les métaux lourds sont des polluants de l environnement et des êtres vivants, caractérisés par leurs propriétés de bioaccumulation. Leur impact sur la santé humaine n est pas négligeable, ce qui incite les autorités à évaluer et à gérer les risques qui leur sont associés. La DGCCRF de Bordeaux cherche à améliorer ses méthodes analytiques pour répondre aux nouvelles normes internationales qui différencient les espèces chimiques les plus dangereuses, et garantir ainsi la sécurité alimentaire des consommateurs. L arsenic a été étudié pour réaliser sa spéciation tandis qu un nouvel appareillage a été validé pour le dosage du mercure. La denrée alimentaire "algues" a fait l objet d une attention toute particulière du fait d un marché en plein essor et de ses propriétés de bioconcentrationGRENOBLE1-BU Médecine pharm. (385162101) / SudocSudocFranceF