Dibenzodiazepinone-type mAChR ligands: radio- and fluorescence labeling enable unveiling of dualsteric M₂R binding and conjugation to short peptides as an avenue to highly selective M₂R ligands

In humans, the family of muscarinic acetylcholine receptors (mAChR, MRs) comprises five subtypes (M1R-M5R), which are members of the class A GPCR superfamily and mediate the action of the neurotransmitter acetylcholine in the central and peripheral nervous system. For instance, the M2R, which binds to Gi/o heterotrimeric G-proteins, acts as a presynaptic autoreceptor in the brain and in the periphery. Accordingly, selective M2R antagonism in the CNS results in an enhanced cholinergic transmission, representing a potential therapeutic approach to increase cholinergic function in Alzheimer patients. The development of high affinity and selective MR ligands has been hampered by the high conservation of the orthosteric (acetylcholine) binding site within the five MR subtypes. Therefore, highly selective molecular tools and therapeutic agents, acting at MRs, are lacking. MRs possess various accessory (allosteric) binding sites, which are less conserved. This prompted the design of numerous allosteric MR ligands. However, allosteric modulators with high MR affinity (Ki < 0.1 µM) are not described to date. The dualsteric ligand approach, that means, the design of ligands, which simultaneously bind to the orthosteric pocket and an allosteric site, was suggested as a promising strategy to develop high-affinity and highly selective MR ligands. In order to investigate the binding mode of dibenzodiazepinone-type MR antagonists at the M2R, three radiolabeled compounds, a monomeric ([3H]19) and two homodimeric ([3H]33, [3H]47) derivatives, were prepared. The results from various detailed experiments performed with [3H]19 and [3H]33, in particular saturation binding studies in the absence and in the presence of reported allosteric M2R ligands, strongly suggested that the studied type of M2R antagonists bind dualsterically to the M2R, interacting simultaneously with both, the orthosteric and the ‘common’ allosteric binding site. The results from molecuclar dynamics (MD) simulations, performed with the M2R (inactive state) bound to 19 or 33, were consistent with the conclusions drawn from radioligand binding studies. Interestingly, the homodimeric ligand 33, in contrast to the monomeric ligand 19, showed a long residence time at the M2R, which might be attributed, as also suggested by MD simulations, to additional contacts of 33 with amino acids constituting the allosteric vestibule. Moreover, five fluorescently labeled dibenzodiazepinone-type MR ligands (including two homodimeric and one heterodimeric derivative) were prepared using red-emitting cyanine dyes. Equilibrium competition binding studies with the orthosteric antagonist [3H]NMS revealed high M2R affinities for all fluorescent ligands (pKi = 8.85-9.59). Flow cytometric and high-content imaging-based binding experiments with a monomeric (62) and a homodimeric (64) fluorescent ligand in the presence of the reported allosteric modulator W84 (8) suggested that the fluorescent dibenzodiazepinone-type MR ligands bind dualsterically to the M2R, as also concluded for the tritium-labeled analogs [3H]19 and [3H]33. Confocal microscopy with 62 and 64 at CHO-hM2R cells revealed that binding of the fluorescent probes occurred mainly at the cell membrane, and an increase of intracellular fluorescence was not observed with increasing incubation time. Finally, aiming at MR ligands with improved M2R selectivity, the dibenzodiazepinone pharmacophore was conjugated to several di- and tripeptides via two different linkers yielding a series of non-peptide/peptide hybrid ligands (DIBA-peptide conjugates). The affinity and the selectivity profile of these compounds was assessed by radioligand competition binding at CHO-hMxR cells (x = 1-5) using [3H]NMS. The introduction of two basic amino acids (Arg, Lys) yielded the DIBA-peptide conjugates with the highest M2R selectivity (compound 96 (aliphatic linker, peptide sequence Lys-Arg): Ki M1R:M2R:M3R:M4R:M5R = 58:1:6900:99:300; compound 108 (basic linker, peptide sequence Lys-Ala-Arg): Ki M1R:M2R:M3R:M4R:M5R = 49:1:1800:70:3500). The DIBA-peptide conjugates 96 and 108 represent the most selective M2R antagonists reported to date with M2R binding constants in the low nanomolar (96, pKi = 9.00) and in the picomolar (108, pKi = 10.21) range. Thus, this new class of compounds represents a valuable basis for the development of high affinity and highly selective M2R antagonists. Taken together, the present work afforded new radio- and fluorescence labeled molecular tools, which bind with high affinity to the M2R. Moreover, the conjugation of the dibenzodiazepinone pharmacophore to short peptides yielded high affinity M2R ligands with improved M2R selectivity compared to previously reported M2 subtype preferring MR ligands

Endovascular treatment of renal artery thrombosis caused by umbilical artery catheterization

AbstractRenal arterial thrombosis, usually in association with aortic thrombosis, has been reported as a result of prolonged neonatal umbilical artery catheterization. A case of renal artery thrombosis attributable to umbilical artery catheterization, resulting in malignant renovascular hypertension, in a 15-day-old neonate, treated by catheter-directed thrombolysis through the involuting umbilical artery, was studied. Resolution of systemic hypertension and partial return of right renal function followed rapid thrombus dissolution. (J Vasc Surg 1998;28:949-53.

Patterns of Drug Use and Serum Sodium Concentrations in Older Hospitalized Patients : A Latent Class Analysis Approach

Peer reviewedPublisher PD

Insertion of Nanoluc into the Extracellular Loops as a Complementary Method To Establish BRET-Based Binding Assays for GPCRs

Luminescence-based techniques play an increasingly important role in all areas of biochemical research, including investigations on G protein-coupled receptors (GPCRs). One quite recent and popular addition has been made by introducing bioluminescence resonance energy transfer (BRET)-based binding assays for GPCRs, which are based on the fusion of nanoluciferase (Nluc) to the N-terminus of the receptor and the occurring energy transfer via BRET to a bound fluorescent ligand. However, being based on BRET, the technique is strongly dependent on the distance/orientation between the luciferase and the fluorescent ligand. Here we describe an alternative strategy to establish BRET-based binding assays for GPCRs, where the N-terminal fusion of Nluc did not result in functioning test systems with our fluorescent ligands (e.g., for the neuropeptide Y Y1 receptor (Y1R) and the neurotensin receptor type 1 (NTS1R)). Instead, we introduced Nluc into their second extracellular loop and we obtained binding data for the fluorescent ligands and reported standard ligands (in saturation and competition binding experiments, respectively) comparable to data from the literature. The strategy was transferred to the angiotensin II receptor type 1 (AT1R) and the M1 muscarinic acetylcholine receptor (M1R), which led to affinity estimates comparable to data from radioligand binding experiments. Additionally, an analysis of the binding kinetics of all fluorescent ligands at their respective target was performed using the newly described receptor/Nluc-constructs

Red-Emitting Dibenzodiazepinone Derivatives as Fluorescent Dualsteric Probes for the Muscarinic Acetylcholine M2 Receptor

Fluorescently labeled dibenzodiazepinone-type muscarinic acetylcholine receptor (MR) antagonists, including dimeric ligands, were prepared using red-emitting cyanine dyes. Probes containing a fluorophore with negative charge showed high M2R affinities (pKi (radioligand competition binding): 9.10-9.59). Binding studies at M1 and M3-M5 receptors indicated a M2R preference. Flow cytometric and high-content imaging saturation and competition binding (M1R, M2R, and M4R) confirmed occupation of the orthosteric site. Confocal microscopy revealed that fluorescence was located mainly at the cell membrane (CHO-hM2R cells). Results from dissociation and saturation binding experiments (M2R) in the presence of allosteric M2R modulators (dissociation: W84, LY2119620, and alcuronium; saturation binding: W84) were consistent with a competitive mode of action between the fluorescent probes and the allosteric ligands. Taken together, these lines of evidence indicate that these ligands are useful fluorescent molecular tools to label the M2R in imaging and binding studies and suggest that they have a dualsteric mode of action

Effetto dei promotori su catalizzatori a base di ferro nella reazione di cracking catalitico del metano per la produzione di idrogeno

Hydrogen is one of the most used molecules by many industries for a variety of applications. The majority of hydrogen is used for chemical production (ammonia synthesis and methanol synthesis) and fuels hydrotreatments. Steam reforming is the most frequently applied process to produce hydrogen today (grey hydrogen). This process is related to substantial process-related CO2 emissions. To reduce CO2 emissions in atmosphere it is necessary to develop new CO2-free processes and to reduce environmental impact of hydrogen production. One of these processes is catalytic methane decomposition (turquoise hydrogen). The co-product of this process is solid carbon, which is responsible for catalyst deactivation, so it is necessary to study catalysts which increase hydrogen production and retard deactivation. The subject of this work is to study the effect of promoters on Fe-based catalysts to improve catalytic performances and maximize hydrogen productivity. Catalysts before reaction have been characterized by H2-TPR, XRD and N2-adsorption/desorption to evaluate the influence of promoters on chemical and physical characteristics of the catalysts. Catalysts after reaction have been characterized by XRD, SEM, TEM, and Raman spectroscopy to identify the type of carbonaceous phase co-produced. The quality of the CNTs and the hydrogen yield are more related to the reaction conditions than to the presence of a promoter

Ruolo del recettore PPAR-gamma nella trasduzione del segnale indotta da microparticelle nell'epitelio delle vie aeree

L'infiammazione delle vie aeree è una caratteristica comune a molte malattie dell'apparato respiratorio, tra cui la polmonite, la broncopneumopatia cronica ostruttiva, l'asma, e la sindrome da distress respiratorio acuto. Questa reazione infiammatoria è caratterizzata dal reclutamento di leucociti di origine ematica all'interno delle vie aeree. Sebbene sia stato per molto tempo considerato come una barriera passiva, l'epitelio delle vie aeree, posto all'interfaccia tra l'ambiente esterno ed il corpo, partecipa in realtà attivamente alla risposta infiammatoria. Nell'ambito di un vasto numero di molecole prodotte dall'epitelio delle vie aeree, svolgono un ruolo fondamentale molecole di adesione e mediatori solubili coinvolti nel reclutamento di leucociti infiammatori. Tra i mediatori solubili coinvolti nel reclutamento di leucociti, un ruolo centrale è svolto da interleuchina-8 (IL-8) e dalla proteina chemotattica per i monociti-1 (MCP-1), rispettivamente membri della famiglia di chemochine denominate CXC e CC, e coinvolte rispettivamente nel reclutamento di polimorfonucleati (PMN) e monociti. Numerosi agonisti stimolano la sintesi di queste molecole da parte delle cellule epiteliali delle vie aeree svolgono quindi un ruolo pro-infiammatorio. Le microparticelle (MP), chiamate anche ectosomi e microvescicole, sono frammenti di membrana liberati virtualmente da tutte le cellule eucariote a seguito di attivazione o durante apoptosi. Sebbene i meccanismi intracellulari che portano alla liberazione delle MP non siano ben conosciuti, si ritiene che sia implicata la mobilizzazione del calcio intracellulare. Considerate originariamente artefatti legati alla manipolazione in vitro delle cellule o, al più, frammenti cellulari liberati durante la necrosi e privi di significato fisiologico, le MP sono state recentemente coinvolte in vari processi, tra cui la coagulazione del sangue e l'infiammazione. Per le loro caratteristiche le MP possono rappresentare un nuovo elemento subcellulare, in grado di promuovere la liberazione dei mediatori pro-infiammatori. In studi precedenti, svolti nel nostro laboratorio, è stato dimostrato che i monociti/macrofagi umani, stimolati con calcio ionoforo A23187 e istamina, liberano MP capaci di aumentare l’espressione di IL-8 ed MCP-1 a livello dell’epitelio delle vie aeree. Questo risultato ha diretto la mia tesi verso l’individuazione dei possibili meccanismi di trasduzione del segnale indotti dalle MP nelle cellule epiteliali delle vie aeree, nell’ambito della loro azione pro-infiammatoria. Per raggiungere questo obbiettivo abbiamo condotto una prima serie di esperimenti per ricercare un possibile fattore di trascrizione indotto dalle MP nelle cellule epiteliali delle vie aeree; abbiamo individuato come possibile fattore di trascrizione attivato dalle MP il fattore NF-kB. Questo mio primo obiettivo è stato ottenuto mediante la tecnica EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) che viene utilizzata per studiare le interazioni DNA-proteina, nel mio caso DNA-NF-kB. L’ EMSA si basa sulla capacità che hanno i complessi DNA-proteina, in un gel di poliacrilammide, di migrare più lentamente del DNA non legato producendo uno “shift” nella migrazione delle bande di DNA marcato. In questo esperimento è stato usato come controllo positivo il TNF-α che è noto avere un meccanismo NF-kB dipendente. Dimostrata la dipendenza dal fattore di trascrizione NF-kB dell’azione pro-infiammatoria delle MP nelle cellule epiteliali delle vie aeree, abbiamo effettuato un'altra serie di esperimenti per meglio caratterizzare i meccanismi intracellulari indotti dalle MP che portano al rilascio di citochine. A questo proposito abbiamo indagato sul ruolo di agonisti PPAR-gamma come il Rosiglitazone e il 15-deoxi-delta12,14-PGJ2 (15d-PGJ2) sulla modulazione dell’ espressione di IL-8 ed MCP-1 indotta da MP sull’epitelio delle vie aeree. I PPAR sono fattori di trascrizione attivati da ligando appartenenti alla superfamiglia dei recettori ormonali nucleari. Se ne conoscono solo tre isoforme: alfa,beta,gamma. Conosciuti principalmente per il loro ruolo nella regolazione del metabolismo glucidico e lipidico, oggi sono coinvolti anche nella regolazione di altri fenomeni, come l’infiammazione. E’ stato dimostrato, infatti, che agonisti dei PPAR-gamma inibiscono il rilascio di mediatori pro-infiammatori da parte dei monociti e delle cellule dell’epitelio sia alveolare che bronchiale; questi effetti sono stati principalmente attribuiti ad antagonismo del fattore nucleare di trascrizione NF-kB. Nella seconda serie di esperimenti da me svolti, le MP sono state generate con calcio ionoforo da monociti/macrofagi ed incubate con le cellule dell’epitelio delle vie aeree pretrattate con agonisti dei recettori PPAR-gamma, Rosiglitazone e 15d-PGJ2. Le concentrazioni di IL-8 ed MCP-1 nel sovranatante delle cellule epiteliali sono state misurate mediante kit ELISA commercialmente disponibili. Come modello delle vie aeree sono stati usati due diversi tipi di cellule: le A549 e le BEAS-2B. Le prime sono cellule tumorali alveolari, le seconde sono cellule di epitelio bronchiale derivanti da un soggetto sano deceduto per cause traumatiche e immortalizzate. Da studi precedenti fatti nel nostro laboratorio si è osservato che dopo incubazione delle cellule A549 e BEAS-2B con MP, la sintesi di IL-8 e MCP-1 da parte di queste cellule aumenta rispetto alla loro concentrazione basale. Questo dato dimostra il ruolo modulatorio che hanno le MP nell’induzione di fattori pro-infiammatori. Nei miei esperimenti, invece, è stata osservata una riduzione nella sintesi di IL-8 e MCP-1 in cellule pretrattate con l’agonista PPAR-gamma, Rosiglitazone, e successivamente incubate con MP. La riduzione osservata nella sintesi di queste due citochine è pari a circa il 50%. Nelle cellule pretrattate con l’agonista 15d-PGJ2 prima di essere incubate con MP si è verificata una diminuzione dell’espressione di MCP-1 superiore al 50%. I risultati ottenuti mediante tecnica ELISA sono stati affiancati a indagini di biologia molecolare allo scopo di confermare che le variazioni di concentrazioni delle chemochine riflettono variazioni a livello trascrizionale. Possiamo concludere che le MP mostrano un meccanismo d’azione NF-kB dipendente; inoltre i recettori PPAR-gamma attivati modulano l’azione pro-infiammatoria delle MP probabilmente attraverso inibizione funzionale del fattore di trascrizione NF-kB. I due agonisti dei recettori PPAR-gamma Rosiglitazone e 15d-PGJ2 mostrano un ruolo inibitorio nei confronti dell’infiammazione