Prion disease in brain slice cultures

Prion diseases or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are lethal infectious diseases affecting humans and a variety of animal species. The prevailing hypothesis suggests that the infectious disease-causing particle termed “the prion” consist of a misfolded form of the normal cellular prion protein (PrPC) that has been converted into a disease-associated form (PrPSc). It is believed that PrPSc, either as a monomer or as a highly order aggregate, catalyses the conversion of PrPC into PrPSc and thus becomes self-propagating (i.e. infectious). The molecular composition of PrPSc, the mechanism of conversion and how the conversion leads to pathology is not clear. None-the-less, all familiar TSEs display mutations within the Prnp locus and ablation of Prnp confers resistance to TSEs in mice. In the main part of the thesis I investigated the role of microglia in prion disease. In order to do so, I first established a novel assay allowing for prion replication in organotypic cerebellar slice cultures. These cultures are thin slices of living cerebellar brain tissue that can be kept alive for up to 26 weeks ex vivo. In prion-infected cultures prepared from mice overexpressing PrPC, PrPSc could be recovered as early as 3 weeks post-inoculation. I transmitted the prion-infected slices to a secondary prion transmission assay that allowed us to determine the amount of infectivity generated within the slices. The amount of infectivity recovered from organotypic cerebellar slices 5 weeks post-inoculation was equal to what could be recovered from a terminally scrapie-sick mouse 150 days post-inoculation. No infectivity was recovered from prion-exposed Prnpo/o slices. I could show that the localization and the replication properties of PrPSc in our cultures behaved similar to what is seen in vivo. Next, I utilized a transgenic mouse model (CD11b-HSVTK) that allowed for the conditional depletion of microglia. Microglia could be ablated from CD11b-HSVTK slices within 2 weeks with no obvious consequences for other neural cells populations. A 15-fold increase in prion infectivity was observed 30 days post-inoculation in prion-infected microglia-depleted slices relative to non-depleted slices. This increase in prion-infectivity could blocked by adding back exogenous macrophages to microglia-depleted tissue. In addition, depletion of microglia allowed for an infection of the tissue with an amount of prions that would normally not lead to an infection. Our results strongly suggests that microglia play a role in inhibiting prion replication and could represent an important central nervous system (CNS) anti-prion defense. For the second part of the thesis I developed a novel method to distinguish between the inoculum used to infect cells (input) and the newly synthesized prions that can be recovered from prion-infected cells (output). This technique allows for the study of prion-replication in non-diving cells without the interference of persisting residual inoculum, which could interfere with the interpretation of the experiment. I use homogenates of prion-infected C4/C4 mice that express a deletion mutant of the prion protein lacking the octa-repeat region (ΔPrP32-93). Brain homogenates from these mice can be used to infect cultures expressing the full-length prion protein. PrPSc is subsequently detected with an antibody recognizing a linear epitope in the octa-repeat region of PrPC. This epitope is absent in the inoculum, but present in the newly generated PrPSc, allowing for a specific detection of de novo replicated PrPSc. This allows for the investigation of which post-mitotic or slowly dividing cells can be prion-infected. I show with the technique that cerebellar granule neurons and astrocytes can be infected. I also show that I cannot infect microglia, most likely due to their low expression of PrPC. I am currently testing which other CNS or peripheral nervous system (PNS)-derived cells can support prion replication. Zusammenfassung Prionenerkrankungen oder transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE) sind tödlich verlaufende, übertragbare Erkrankungen, die eine Vielzahl verschiedener Spezies befallen können. Eine vorherrschende Hypothese besagt, dass das infektiöse, die Erkrankung auslösende Agens – auch als „Prion“ bezeichnet – aus fehlgefaltetem normalem zellulärem Prionprotein (PrPC) besteht, welches in die Erkrankungs- assoziierte Form (PrPSc) konvertiert worden ist. Man nimmt an, dass PrPSc, entweder als Monomer oder als Aggregat hoher Organisationsstufe, die Konversion von PrPC zu PrPSc katalysiert und auf diese Weise im infektiösen Sinne selbst-replizierend wird. Weder die molekulare Zusammensetzung von PrPSc und der Mechanismus der Konversion, noch der Zusammenhang zwischen der Umfaltung und den zu beobachtenden pathologischen Veränderungen sind bekannt. Allerdings weisen alle familiären Fälle von TSE Mutationen im Prnp Lokus auf und die genetische Ausschaltung („knockout“) von Prnp bewirkt in Mäusen eine Resistenz gegen TSE. Der Hauptteil der Doktorarbeit befasst sich mit der Rolle von Mikrogliazellen in Prionerkrankungen. Als Vorraussetzung hierfür musste zunächst ein neuer Assay entwickelt werden, um die Replikation der Prionen in organotypischen zerebellären Gewebskulturen („slice cultures“) zu untersuchen. Bei diesen Kulturen handelt es sich um dünne Schnitte aus lebendem zerebellärem Gewebe, welches ex vivo bis zu 26 Wochen am Leben erhalten werden kann. In prioneninfizierten slice cultures aus PrPC überexprimieren Mäusen, konnte PrPSc bereits 3 Wochen nach Inokulation nachgewiesen werden. Die mit Prionen infizierten slice cultures wurden nachfolgend in einem weiteren Prionen Transmissionsexperiment untersucht, welches erlaubt die Menge an in den Kulturen erzeugter Infektiosität zu bestimmen. Die Menge an Infektiosität, welche nach 5 Wochen in den slice cultures nachgewiesen werden konnte, entsprach derjenigen einer terminal an Scrapie erkrankten Maus 150 Tage nach Inokulation. Dagegen fand sich keine Infektiosität in Prion exponierten Kulturen aus Prnpo/o Mäusen. Es zeigte sich, dass PrPSc in den Kulturen eine ähnliche räumliche Verteilung und Replikationseigenschaften wie in der in vivo Situation aufwies. Im weiteren Verlauf wurde ein transgenes Mausmodell (CD11b-HSVTK) verwendet, in welchem eine getriggerte Depletion von Mikrogliazellen möglich ist. Mikrogliazellen konnten aus Kulturen von CD11b-HSVTK Mäusen innerhalb von zwei Wochen ohne offensichtliche negative Konsequenzen für andere (neuronale) Zellpopulationen depletiert werden. In infizierten Mikroglia-depletierten Kulturen konnte 30 Tage nach Inokulation – im Vergleich zu nicht depletierten Kulturen – ein 15-facher Anstieg der Prion-Infektiosität beobachtet werden. Der Anstieg der Prion- Infektiosität konnte durch Zugabe von exogenen Makrophagen aufgehoben werden. Zusätzlich konnten durch die Depletion von Mikrogliazellen die Kulturen schon mit einer Prionendosis infiziert werden, die normalerweise nicht für eine Infektion ausreichen würde. Die Ergebnisse legen nahe, dass Mikrogliazellen an einer Hemmung der Replikation von Prionen beteiligt sind und einen wichtigen Abwehrmechanismus des ZNS gegen Prionen darstellen. Im zweiten Teil meiner Doktorarbeit habe wurde eine neue Methode entwickelt, um zwischen dem für die Zellinfektion benutzten Inokulum (Input) und den neu synthetisierten Prionen, die in infizierten Zellen nachgewiesen werden können (Output), zu unterscheiden. Diese Technik erlaubt es, die Replikation von Prionen in postmitotischen Zellen ohne den Einfluss von noch vorhandenem restlichem Inokulum, welches die Interpretation des Experimentes beeinträchtigen könnte, zu untersuchen. Hierzu wurden Homogenate von Prionen infizierten C4/C4 Mäusen, welche eine Deletionsmutante des Prionproteins ohne die Oktarepeatregion (ΔPrP32- 93) exprimieren, verwendet. Hirnhomogenate von diesen Mäusen können zur Infektion von Kulturen benutzt werden, welche das Volllängen Prionprotein exprimieren. In der Folge kann PrPSc mit einem Antikörper detektiert werden , der gegen ein lineares Epitop in der Oktarepeatregion von PrPC gerichtet ist. Dieses Epitop fehlt im Inokulum, ist allerdings im neu entstandenen PrPSc enthalten, was einen spezifischen Nachweis von de novo erzeugtem PrPSc ermöglicht. Somit ist es möglich zu untersuchen, welche postmitotischen oder sich langsam teilenden Zellen mit Prionen infizierbar sind. Mit dieser Technik konnte gezeigt werden, dass Neuronen der Granularzellschicht des Kleinhirnkortex und Astrozyten mit Prionen infiziert werden können. Ausserdem wurde nachweisen, dass Mikrogliazellen nicht infizierbar sind, was am wahrscheinlichsten an den geringen Expressionsspiegeln von PrPC in diesem Zelltyp liegt. Gegenwärtig wird untersucht, welche weiteren Zellen des ZNS oder des peripheren Nervensystems (PNS) die Replikation von Prionen unterstützen können