GENÔMICA COMPARATIVA DE ISOLADOS CLÍNICOS DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA RESISTENTES À COLISTINA

Introdução/Objetivo: Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista comumente reportado como causador de infecções em ambientes hospitalares, cujo tratamento está se tornando mais desafiador devido a sua emergência como patógeno Multirresistente (MDR). A colistina é um antibiótico de último recurso usada contra cepas MDR de P. aeruginosa. No entanto, com o aumento do uso de polimixinas, o surgimento de isolados de P. aeruginosa resistentes a essas drogas tem sido cada vez mais relatado em todo o mundo. Com base nesse contexto, esse estudo objetivou realizar uma comparação entre genomas de P. aeruginosas resistentes a colistina. Metodologia: Este estudo foi realizado a partir da comparação de 46 genomas de P. aeruginosa, sendo 40 deles obtidos através do banco de dados do NCBI e 5 genomas, de isolados clínicos de P. aeruginosa resistentes a colistina provenientes dos serviços de microbiologia dos laboratórios de dois hospitais públicos da cidade do Recife/PE. As sequências foram analisadas com as ferramentas Geneious Prime® (Biomatters), MEGA (Molecular evolutionary genetics analysis) e BUSTED para alinhamento e análise comparativa, construção de árvores filogenéticas e busca por evidências de seleção positiva de 4 Sistemas de dois componentes (PhoPQ, PmrAB, ParRS, CprRS) presentes nas cepas de P. aeruginosa analisadas e previamente relacionados com a resistência a Colistina. A cepa PA01 foi utilizada como referência. Resultados: Foi possível identificar SNPs importantes para a aquisição da resistência. Os genes responsáveis pela regulação (pmrA, phoP, parR, cprR) mostraram-se nos grupos de isolados resistentes mais consistentes quando comparados com os codificadores de histidina quinase. Os genes pmrB, parS e cprS, tiveram um número elevado de substituições pontuais quase sempre encontradas em cepas resistentes. As árvores filogenéticas demonstraram o mesmo caminho evolutivo para aquisição da resistência. Conclusão: Não foi possível identificar SNPs de destaque em um dos TCSs dentre os demais em relação a resistência a Colistina. Os genes responsáveis pela codificação da proteína histidina quinase sofreram mais mutações que podem impactar a sua função, em relação aos seus complementos reguladores. As linhagens devem ter sofrido o mesmo caminho evolutivo, em um fenômeno de convergência adaptativa, como uma resposta à pressão seletiva imposta pela presença do antimicrobiano

GENES DE REFERÊNCIA PARA ESTUDOS DE EXPRESSÃO RELATIVA POR QPCR EM ISOLADOS DE KLEBSIELLA PNEUMONIAE

Introdução/Objetivo: Isolados de Klebsiella pneumoniae resistentes à multiplas drogas têm sido extensivamente reportados em todo o mundo. Alguns determinantes de resistência tornaram-se mais preocupantes pela sua disseminação, como o gene blakpc, já reportado em cepas com altos níveis de resistência aos carbapenêmicos. Em determinados contextos, esse fenômeno é atribuído a mecanismos adicionais, como por exemplo, a regulação da expressão desse gene. Esse trabalho avaliou a estabilidade da expressão de genes candidatos a controles endógenos em K. pneumoniae para aplicação em estudos de expressão relativa por qPCR. Métodos: Foram pré-selecionados vinte e um pares de iniciadores candidatos a controles endógenos, submetidos a análises in sílico, avaliando-se: amplificação nos principais grupos clonais de K. pneumoniae; tamanho do fragmento; temperatura de melting e formação de estruturas secundárias. Os primers foram validados pelo método de curva padrão. O RNA foi extraído usando TRIzol® e o cDNA, sintetizado com o Kit EasyScript™. As reações de qPCR foram realizadas no equipamento StepOneTM, com o fluoróforo SYBR® Green. Foram utilizados isolados clínicos com distintos perfis de susceptibilidade aos carbapenêmicos para testar a estabilidade dos genes frente a exposição com antimicrobiano. Os dados foram analisados no software BestKeeper. Resultados: Os primers para os genes proC, rpoC, rho, tuf e rpoB foram validados. Após análises no BestKeeper, os genes rpoC, rpoB, proC e rho, foram categorizados como os mais estáveis. A expressão relativa do gene blaKPC, normalizada com os distintos controles endógenos, mostrou resultados semelhantes, indicando que os genes selecionados são bons normalizadores para estudos de expressão. O isolado com maior concentração inibitória mínima (CIM) para os carbapenêmicos, apresentou maiores níveis de expressão quando comparado ao isolado com menor CIM, utilizando os genes rpoC, rpoB e proC como controles endógenos. Conclusão: Evidencia-se a importância de avaliar criteriosamente os primers descritos na literatura como etapa anterior às análises de expressão relativa, pois a estabilidade dos genes está associada a condição imposta nas análises e pode gerar resultados não-válidos, além de equívocos de entendimento dos fenótipos. Estudos de estabilidade dos genes de controles endógenos em distintas condições são de suma importância para a confiabilidade dos resultados de qPCR

ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DO NÚMERO DE CÓPIAS NA EXPRESSÃO DO GENE BLAKPC EM ISOLADOS CLÍNICOS DE MORGANELLA MORGANII E PROVIDENCIA STUARTII

Introdução/Objetivo: Organismos produtores de Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) são desafiadores em termos terapêuticos e diagnósticos, pois comumente apresentam resistência a todos os beta-lactâmicos. Além disso, esse determinante possui rápida disseminação pela localização do gene blaKPC em plasmídeos transferíveis e transposons. Por esta razão, estudos sugerem que o gene blaKPC pode apresentar diferentes níveis de expressão, bem como variação no número de cópias, influenciando diretamente nos níveis de resistência aos carbapenêmicos. Um fenótipo atípico de susceptibilidade aos carbapenêmicos apresentado por isolados da tribo Proteeae que abrigavam o gene blaKPC motivou este trabalho, que analisou a influência do número de cópias na expressão do gene blaKPC. Métodos: O DNA genômico dos isolados bacterianos foi extraído a partir do kit Wizard™ Genomic DNA Purification. Os genes utilizados como controles endógenos foram selecionados a partir da literatura. Os primers foram desenhados para ambas as espécies bacterianas e posteriormente analisados in sílico. A quantificação absoluta, foi baseada na proporção relativa entre gene alvo e controle endógeno (2-DCq), utilizando equipamento StepOneTM (Applied Biosystems) e o fluoróforo SYBR® Green. Os experimentos de quantificação absoluta foram realizados com o gene alvo, blaKPC, e com os genes de controle endógenos (tufMm, tufPs, tufKp e HKEc). Resultados: As amplificações do gene blaKPC ocorreram no mesmo ciclo de quantificação ou com diferença ≤2 nos isolados analisados, tanto nos isolados clínicos (Mm01 = 13,027; Ps28 = 13,687; Kp125 = 14,74), quanto nos respectivos isolados transformantes (TMm01 = 14,584; TPs28 = 15,807; TF125 = 14,135). As amplificações dos genes controles endógenos se mostraram estáveis e eles foram utilizados para normalizar os dados. A quantificação absoluta relativa do gene blaKPC foi menor ou igual a 2 em todos as linhagens analisadas, indicando que não há diferença significativa no número de cópias entre eles. Conclusão: Apesar dos distintos perfis fenotípicos observados, os dados de quantificação absoluta demonstraram que o número de cópias do gene blaKPC para os isolados transformantes e para os isolados clínicos não variam significativamente, portanto algum mecanismo a nível de regulação transcricional deve estar atuando na expressão do gene blaKPC, influenciando diretamente os níveis de resistência

CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA DE UM ISOLADO CLÍNICO DE KLEBSIELLA PNEUMONIAE ST855 (CC258) PRODUTOR DE KPC-2 E RESISTENTE A POLIMIXINA, RECUPERADO DE UM PACIENTE DE UTI

Introdução/Objetivo: O aumento da incidência de bactérias resistentes a antibióticos no ambiente hospitalar é um problema de saúde global. A caracterização a nível genômico dos determinantes de resistência a antibióticos e dos elementos associados à sua disseminação, desempenham um papel crítico na compreensão e, potencialmente, no controle de patógenos multirresistentes. Esse estudo buscou caracterizar o genoma de um isolado clínico de K. pneumoniae pan-resistente. Métodos: O isolado foi recuperado de uma amostra de urina de um paciente do sexo masculino de 65 anos, internado na UTI de um hospital terciário em Recife/PE. O DNA genômico da amostra foi extraído a partir do kit PureLink™ Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen) e sequenciado na plataforma NextSeq550 (Illumina®). As leituras foram montadas usando o script VelvetOptimiser3. Para caracterização do genoma, as sequências foram anotadas no servidor RAST server (Rapid Annotations using Subsystems Technology). Replicons de plasmídeo foram identificados usando PlasmidFinder 2.0141,147 e os Tipos de Sequência Multilocus (MLSTs) foram identificados no banco de dados Public Databases for Molecular Typing and Microbial Genome Diversity (PubMLST). A investigação de mutações nos genes dos sistemas de dois componentes foi realizada no software Geneious Prime® (Biomatters), usando o genoma da cepa ATCC13883, como referência. Resultados: A busca por determinantes de resistência identificou genes associados à resistência aos betalactâmicos (blashv-81, blatem-1b, blakpc-2, blactx-m-2), aminoglicosídeos (aph(6)-id, aph(4)-ia, aac(6′)-iq, aph(3′')-ib) sulfonamidas (sul1 e sul2), quinolonas (qnrb19), macrolídeos (mph(a) erm(b)) e trimetoprim (dfra15). Diversos desses determinantes estavam sendo carreados por plasmídeos, alguns deles, pertencentes ao grupo de incompatibilidade IncF, com capacidade de mobilização, o que demonstra o potencial de disseminação desse fenótipo. Foram identificadas mutações em genes dos sistemas de dois componentes pmrAB e phoPQ, associadas com a resistência às polimixinas. Conclusão: O genoma analisado carrega determinantes de resistência de codificação plasmidial e cromossomal, o que reforça o potencial de disseminação da resistência. Estudos como este demonstram que as linhagens de K. pneumoniae são capazes de acumular mecanismos como estratégias adaptativas para sobreviver a pressão de antimicrobianos, o que indica a necessidade de novas estratégias para controle no uso de antibióticos

EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE KLEBSIELLA PNEUMONIAE MULTIDROGA RESISTENTE EM HOSPITAIS TERCIÁRIOS NO ESTADO DE PERNAMBUCO

Introdução/Objetivo: Klebsiella pneumoniae é um patógeno oportunista, responsável por causar diversas infecções relacionadas a assistência à saúde. A disseminação de cepas dessa espécie com fenótipo de resistência a múltiplas drogas, tornou-se uma ameaça global, o que faz da vigilância epidemiológica uma abordagem crítica para estimar e combater este fenômeno. Esse estudo analisou os mecanismos de resistência e disseminação de isolados clínicos de K. pneumoniae do estado de Pernambuco, Brasil. Métodos: Os isolados foram coletados em dois hospitais da rede pública de saúde de Pernambuco localizados no Sertão e na região metropolitana do Recife, durante 12 meses. A relação filogenética foi analisada por ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus – Polymerase Chain Reaction) e as sequências tipo foram determinadas por Multi Locus Sequence Typing (MLST). Os padrões de ERIC foram analisados pelo software PyElph e agrupados por Neighbor Joining. Os determinantes de resistência aos betalactâmicos, quinolonas e aminoglicosídeos foram investigados por PCR convencional e, posteriormente, sequenciados para determinação do perfil alélico e análise de mutações em genes constitutivos associados à resistência a essas drogas. As proteínas de membrana externa (OMPs) das cepas resistentes às cefalosporinas e carbapenêmicos foram avaliadas por SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis). Resultados: As análises moleculares de 49 isolados de K. pneumoniae indicaram uma disseminação policlonal de cepas resistentes, de Sequence Types mundialmente disseminados, como ST15 e ST11, carreando mecanismos de resistência aos betalactâmicos, aminoglicosídeos e quinolonas. Genes que codificam determinantes de resistência às penicilinas e cefalosporinas, como as betalactamases blaTEM, blaSHV e blaCTX e aos carbapenêmicos (blaKPC-2 e blaNDM-1), foram predominantes. A resistência às quinolonas nos isolados foi mediada por mutações na Região Determinante de Resistência à Quinolonas dos genes gyrA e parC e pela presença de genes plasmidiais qnrB-1 e qnrS-6. A análise das OMPs por SDS-PAGE indicou uma menor produção de OmpK36 nas cepas resistentes a pelo menos um carbapenêmico. Conclusão: A predominância policlonal de bactérias resistentes no ambiente hospitalar, oportuniza a disseminação horizontal da resistência e o surgimento de linhagens com acúmulo de mecanismos, sinalizando para falhas nas práticas de higienização das unidades de saúde

NEOTROPICAL ALIEN MAMMALS: a data set of occurrence and abundance of alien mammals in the Neotropics

Biological invasion is one of the main threats to native biodiversity. For a species to become invasive, it must be voluntarily or involuntarily introduced by humans into a nonnative habitat. Mammals were among first taxa to be introduced worldwide for game, meat, and labor, yet the number of species introduced in the Neotropics remains unknown. In this data set, we make available occurrence and abundance data on mammal species that (1) transposed a geographical barrier and (2) were voluntarily or involuntarily introduced by humans into the Neotropics. Our data set is composed of 73,738 historical and current georeferenced records on alien mammal species of which around 96% correspond to occurrence data on 77 species belonging to eight orders and 26 families. Data cover 26 continental countries in the Neotropics, ranging from Mexico and its frontier regions (southern Florida and coastal-central Florida in the southeast United States) to Argentina, Paraguay, Chile, and Uruguay, and the 13 countries of Caribbean islands. Our data set also includes neotropical species (e.g., Callithrix sp., Myocastor coypus, Nasua nasua) considered alien in particular areas of Neotropics. The most numerous species in terms of records are from Bos sp. (n = 37,782), Sus scrofa (n = 6,730), and Canis familiaris (n = 10,084); 17 species were represented by only one record (e.g., Syncerus caffer, Cervus timorensis, Cervus unicolor, Canis latrans). Primates have the highest number of species in the data set (n = 20 species), partly because of uncertainties regarding taxonomic identification of the genera Callithrix, which includes the species Callithrix aurita, Callithrix flaviceps, Callithrix geoffroyi, Callithrix jacchus, Callithrix kuhlii, Callithrix penicillata, and their hybrids. This unique data set will be a valuable source of information on invasion risk assessments, biodiversity redistribution and conservation-related research. There are no copyright restrictions. Please cite this data paper when using the data in publications. We also request that researchers and teachers inform us on how they are using the data