Contrôle spatial de la division cellulaire chez les plantes (rôle des protéines TRM6-TRM7-TRM8 d'Arabidopsis thaliana dans la formation de l'anneau de préprophase)

Les cellules végétales sont entourées d une paroi pecto-cellulosique rigide, soudant les cellules les unes aux autres et empêchant toute migration. Lors de la mitose, le positionnement du plan de division est donc un processus fondamental dans l organisation des tissus puisque les cellules nouvellement formées restent à leur position initiale après la cytokinèse. Chez les plantes terrestres, le plan de division est déterminé lors de la transition G2/M du cycle cellulaire par l anneau de préprophase (PPB), une structure transitoire corticale de microtubules. Les mécanismes mis en jeu pour la formation de la PPB sont encore inconnus. L équipe dans laquelle j ai effectué ma thèse a identifié un complexe régulateur, le complexe TTP, composé de TON1, de la famille de protéines TON1-Recruiting-Motif (TRMs) et d une phosphatase de type 2A où FASS est la sous-unité régulatrice. TON1 et FASS sont impliquées dans l organisation des microtubules corticaux en interphase, et sont indispensables à la formation de la PPB. La famille des protéines TRMs, identifiée récemment, est composée de 34 membres, dont certains sont capables de se lier aux microtubules et de recruter TON1 et FASS au cytosquelette. Les profils d expression des TRMs et les analyses génétiques préliminaires suggèrent que certaines auraient un rôle en interphase, alors que d autres pourraient être impliquées dans la formation de la PPB. Mon projet était d identifier et de caractériser, si elles existent, les TRMs impliquées spécifiquement dans la formation de la PPB. L analyse des données de transcriptome a révélé qu un des gènes de la famille TRM, le gène TRM7, présente un pic d expression en mitose. Nous avons d'abord montré que TRM7 est spécifiquement exprimée dans les tissus en division. L utilisation d une fusion génomique TRM7-3xYpet indique d'autre part que la protéine TRM7 n est exprimée qu au stade G2/M. Elle est localisée à la PPB et disparaît en début de métaphase, peu après dépolymérisation de la PPB. TRM7 est ainsi le seul marqueur spécifique de la PPB identifié à ce jour chez les plantes, puisque toutes les autres protéines localisées à la PPB marquent également les autres structures mitotiques ou le cytosquelette d interphase. TRM7 fait partie d un sous-groupe de trois TRM partageant environ 74% de similarité de séquence. L analyse phénotypique du mutant trm7, ainsi que celui du triple mutant trm6 trm7 trm8 a montré que ce sous-groupe de protéines joue un rôle majeur dans la formation de la PPB. Près de la moitié des cellules du mutant trm7 présentent un stade préprophase aberrant alors que 100% des cellules du triple mutant au stade G2/M sont affectées, la très grande majorité se divisant sans former de PPB. Étonnamment, la morphologie de ces mutants est peu perturbée et le phénotype n est en rien comparable au syndrome développemental sévère des mutants ton1 ou fass dépourvus de PPB. De plus, les plans de division ne sont pas aléatoires comme c est le cas pour les mutants ton1 et fass. Nos résultats permettent donc d'apporter une nouvelle lumière sur le rôle de la PPB dans la détermination du plan de division. Pour la première fois, grâce au triple mutant trm6 trm7 trm8, nous avons réussi à découpler les fonctions interphasiques de la fonction mitotique du complexe TTP, ce qui était jusqu alors impossible chez les mutants ton1 ou fass où les défauts en interphase et les défauts dus à l absence de PPB étaient indissociables. Tous les composants du complexe TTP partageant des similarités avec des protéines centrosomales animales faisant partie du même complexe, nous avons exploré dans un projet annexe, la conservation des interactions au sein du complexe animal. Nous avons pu mettre en évidence, grâce au système double-hybride chez la levure, des interactions entre protéines animales et protéines végétales.Plant cells are embedded within a semi-rigid pecto-cellulosic cell wall that prevents cell migration. As a consequence, three-dimensional cellular organization of tissues mostly results from polarized cell division, since new cells remain in place after mitosis with no possibility for subsequent relocation. In land plants, the division plane is determined pre-mitotically, during the G2 to M phase transition by the preprophase band (PPB), a transient, premitotic microtubule array. The molecular pathways leading to preprophase band formation are still largely unknown. Our team has identified a regulatory complex, the TTP complex, composed of TON1, TRM and a Protein Phosphatase 2A complex with FASS as the regulatory subunit. Both TON1 and FASS have been shown to be involved in cortical microtubules organization during both interphase and PPB formation. The TRM super family is a newly identified protein family composed of 34 members, some of which are microtubule-associated proteins able to recruit TON1 and FASS to the microtubules. Based on TRM expression profiles and preliminary genetic analysis, we hypothesized that some TRMs could have a role in interphase, while others could be involved in PPB formation. My project was to identify and characterize TRMs specifically involved in PPB formation, if any. Transcriptomic analysis using the Genevestigator tool revealed that one TRM gene, TRM7, has a peak of expression at mitosis. TRM7 promoter GUS fusion analysis confirmed that TRM7 is expressed in all dividing tissues and in situ hybridizations of shoot apical meristems revealed a patchy pattern of expression, typical of cell cycle-regulated genes. Remarkably, the genomic TRM7-3xYFP fusion is only expressed at the G2/M transition where it localizes to the PPB, persists beyond PPB degradation until the beginning of metaphase and then disappears. To our knowledge, this makes TRM7 the only PPB-specific marker identified in plants so far, since all other PPB-associated markers label others structures as well, both interphasic or mitotic. TRM7 is part of the TRM6-7-8 sub-family, which share 74% of similarity. Phenotypic analysis of the trm7 and trm6 trm7 trm8 triple mutant revealed a major role of this sub-group in PPB formation. Almost half trm7 cells and all trm6 trm7 trm8 cells displayed an abnormal preprophase stage, the vast majority of the triple mutant cells dividing without PPB. Surprisingly, the triple mutant phenotype is rather mild compare to the severe developmental syndrome of PPB-lacking ton1 or fass plants. Moreover, although often shifted, division plane positioning is far from being fully randomized as in ton1 and fass mutants. Our results show that, for the first time, we have fully uncoupled the mitotic function of the TTP complex from its interphasic function, contrarily to other TTP mutants analyzed so far, where division and interphase defects are indistinguishable. Moreover, these findings question the central role of the PPB in division plane positioning. All TTP components share similarities with animal proteins assembled within a complex at the centrosome. In a side project, we studied the conservation of protein interactions within the animal complex and were able to find cross-interactions between animal and plant proteins in yeast two-hybrid experiments.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Caractérisation de nouveaux constituants du cytosquelette chez Arabidopsis thaliana (les protéines TON et leurs partenaires)

Le cytosquelette des cellules végétales orchestre de nombreux processus de croissance, morphogenèse et différenciation. L analyse de mutants chez Arabidopsis thaliana a permis l isolement de nouvelles protéines et de leurs partenaires et de mieux comprendre les mécanismes gouvernant la dynamique des microtubules (MTs) et des microfilaments (MFs). Les mutants tonneau et fass présentent d importants défauts morphologiques associés à une désorganisation des MTs corticaux. La protéine TON est conservée chez les plantes, et présente des homologies avec deux protéines centrosomales humaines. Nous avons montré que la fusion TON-GFP est associée aux MTs corticaux. Un crible 2-hybride avait permis d'isoler des partenaires de TON : une centrine et onze protéines inconnues, spécifiques des plantes, partageant cinq motifs conservés, et nommées TIM (TON Interactif Motif). Certains de ces motifs sont conservés chez une protéine centrosomale. La famille TIM compte une trentaine de membres dans le génome d Arabidopsis. De façon surprenante, la fusion GFP-TIM1 se lie aux MTs et/ou aux MFs et nous avons pu identifier le domaine de liaison aux MTs. Nous avons isolé des simples, doubles et quadruple mutants d une sous-famille de 4 protéines (TIM1 à TIM4) et montré que ces protéines sont importantes pour le développement de la plante. L'ensemble de ces résultats suggère que les protéines TON et TIM1 sont impliquées dans la dynamique des MTs corticaux et dans le développement de la plante. TIM1 pourrait également coordonner les réseaux de MTs et de MFs. La famille TIM pourrait se révéler essentielle dans l'organisation spatiale des structures corticales de cytosquelette végétal.The plant cell cytoskeleton is involved in many growth processes, morphogenesis and differentiation. Analysis of Arabidopsis thaliana mutants allowed us to uncover new proteins and their partners, and to better understand mechanisms that govern microtubules (MT) and microfilaments (MF) dynamics. The tonneau and fass mutants show considerable morphologic alterations associated with abnormalities in organization of cortical MTs. TON protein is strongly conserved in plants, and has similarities with two human centrosomal proteins. We have shown that a GFP-TON fusion is associated to the cortical cytoskeleton. A yeast 2-hybrid screen had previously lead to isolation of TON partners: a centrin and of 12 large unknown proteins, specific to plants, sharing 5 conserved motifs and named TIM (TON Interaction Motif). We showed that some of these motifs are conserved in CAP350, a centrosomal protein. The TIM family comprises about 30 members in the Arabidopsis genome. Interestingly, a GFP-TIM1 fusion binds both MTs and/or MFs. We have identified the TIM1 MT binding domain, which corresponds to a highly basic region. In order to study the role of these proteins in plant development, genetic study of one sub-family of 4 proteins (TIM1 to TIM4) has been undertaken. Phenotype analysis of single, double and quadruple mutants show significant defects in development. Taken together, results suggest an involvment of TON and TIM1 proteins in the dynamics of cortical MTs and in plant development. TIM1 could also coordiantes the MT and MF networks during the cell cycle. The TIM family could be essential for spatial organization of plant cortical cytoskeleton structures.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Molecular aspects of microtubule dynamics in plants

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Rapid lnduction by Wounding and Bacterial Infection of an S Gene Family Receptor-like Kinase Gene in Brassica oleracea

International audienceA receptor-like kinase, SRK, has been implicated in the autoincompatible response that leads to the rejection of Self-pollen in Brassica plants. SRK is encoded by one member of a multigene family, the S gene family, which includes sev-era1 receptor-like kinase genes with patterns of expression very different from that of SRK but of unknown function. Here, we report the characterization of a nove1 member of the Brassica S gene family, SFR2. RNA gel blot analysis demonstrated that SFR2 mRNA accumulated rapidly in response both to wounding and to infiltration with either of two bacteria: Xanthomonas campestris, a pathogen, and Escherichia coli, a saprophyte. SFR2 mRNA also accumulated rapidly after treatment with salicylic acid, a molecule that has been implicated in plant defense response signaling pathways. A SFR2 promoter and reporter gene fusion was introduced into tobacco and was shown to be induced by bacteria of another genus, Ralstonia (Pseudomonas) solanacearum. The accumulation of SFR2 mRNA in response to wounding and pathogen invasion is typical of a gene involved in the defense responses of the plant. The rapidity of SFR2 mRNA accumulation is consistent with SFRP playing a role in the signal transduction pathway that leads to induction of plant defense proteins, such as pathogenesis-related proteins or enzymes of phenylpropanoid metabolism

The Arabidopsis TONNEAU2 Gene Encodes a Putative Novel Protein Phosphatase 2A Regulatory Subunit Essential for the Control of the Cortical Cytoskeleton

In Arabidopsis ton2 mutants, abnormalities of the cortical microtubular cytoskeleton, such as disorganization of the interphase microtubule array and lack of the preprophase band before mitosis, markedly affect cell shape and arrangement as well as overall plant morphology. We present the molecular isolation of the TON2 gene, which is highly conserved in higher plants and has a vertebrate homolog of unknown function. It encodes a protein similar in its C-terminal part to B″ regulatory subunits of type 2A protein phosphatases (PP2As). We show that the TON2 protein interacts with an Arabidopsis type A subunit of PP2A in the yeast two-hybrid system and thus likely defines a novel subclass of PP2A subunits that are possibly involved in the control of cytoskeletal structures in plants

Characterization of antisense chalcone synthase transgenic microcuttings

International audienc

Characterization of antisense chalcone synthase transgenic microcuttings

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