Identificação do sítio de ligação ao DNA da proteína NtrX de Herbaspirillum seropedicae

Orientador: Roseli WassemCo-orientador: Rose Adele MonteiroMonografia (Bacharelado) - Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Curso de Graduação em Ciências Biológica

Genes do metabolismo de nitrato em Herbaspirillum Seropedicae : regulação transcricional em análise funcional

Orientadora : Profa. Dra. Liu Un RigoCo-orientadora : Profa. Dra. Roseli WassemDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 16/02/2012Bibliografia: fls. 94-101Resumo: Herbaspirillum seropedicae, membro do grupo ?-proteobactérias, é uma bactéria fixadora de nitrogênio e endofítica que se associa com gramíneas de interesse comercial. Além de apresentar genes envolvidos com a fixação de nitrogênio, este microrganismo também apresenta vários genes envolvidos com o metabolismo de nitrato. Entre estes últimos, estão os genes que codificam para prováveis nitrato redutase assimilatória (nasA e Hsero_2899) e nitrato redutase respiratória (narGHJI). Entretanto, o papel desta última enzima em H. seropedicae não é conhecido, uma vez que este microrganismo não é capaz de crescer em anaerobiose utilizando nitrato como fonte única de nitrogênio. Além de conter genes que codificam para prováveis nitrato redutases, H. seropedicae também contém genes que codificam para prováveis transportadores de nitrato (narK, narK1U e nasFED) e proteínas regulatórias (nasR e narXL). A regulação transcricional de vários destes genes já foi estudada anteriormente, no entanto, ela ainda não é completamente entendida. Desse modo, com o intuito de melhor compreender a regulação de genes envolvidos com o metabolismo de nitrato em H. seropedicae e entender quais são os papéis das nitrato redutases deste microrganismo, neste trabalho foram utilizadas três abordagens. Primeiramente, RNA total a partir de H. seropedicae estirpe SmR1 crescido em nitrato como fonte única de nitrogênio foi extraído, depletado de rRNA e usado para análise transcricional através de RNAseq, em plataforma SOLiD. O transcriptoma de células crescidas em nitrato foi comparado com transcriptoma de H. seropedicae crescido na presença de amônio. De um total de 4804 genes, 1619 estavam diferencialmente expressos, 377 dos quais estavam induzidos e 1242 reprimidos. Os genes narGHI estão entre os genes mais induzidos em nitrato. Os genes que codificam para a provável nitrato redutase assimilatória também estavam induzidos. Na segunda abordagem, ensaios de ?-galactosidase foram utilizados para estudar a regulação dos operons narXL, narK1UGHJImoaA e nasFED. A expressão dos operons narXL e narK1UGHJImoaA foi induzida em baixo nível de oxigenação por Fnr. A expressão do último operon também foi induzida por nitrato. A expressão do operon nasFED foi induzida por nitrato e em condições limitantes de nitrogênio através das proteínas membros do sistemas de dois componentes NtrB/NtrC e NtrY/NtrX. Finalmente, na terceira abordagem, estirpes mutantes nasA e narG de H. seropedicae foram construídas e caracterizadas. Quando estas estirpes foram cultivadas em nitrato como fonte de nitrogênio, o mutante narG- mostrou um crescimento mais lento em relação a estirpe selvagem, enquanto que o mutante nasA- não foi capaz de crescer. Os resultados sugerem que a nitrato redutase assimilatória é essencial para assimilação de nitrato, mas o papel da nitrato redutase respiratória ainda não é conhecido.Abstract: Herbaspirillum seropedicae is an endophytic nitrogen-fixing bacterium that associates with gramineous plants of economic importance. In addition to genes involved with nitrogen fixation, this microorganism also contains some genes involved with nitrate metabolism, including genes encoding a putative assimilatory (nasA e Hsero_2899) and a respiratory nitrate reductase (narGHJI). However, the role of the latter enzyme in H. seropedicae is unknown because this microrganism is not capable to grow in anaerobiosis using nitrate as the only nitrogen source. In addition to the nitrate reductases, this organism also contains genes that encode to putative nitrate transporters (narK, narK1U e nasFED) and regulatory proteins (nasR e narXL). Some of these genes were studied before; however, the regulation and function of them in H. seropedicae are not completely understood. In order to understand how some of the genes related to nitrate metabolism are regulated and the roles of the nitrate reductases, it was used three approaches. First, total RNA from the H. seropedicae strain SmR1 grown on nitrate as the sole nitrogen source was extracted, depleted of rRNA and used for RNAseq transcriptional profiling on a plataform SOLiD 4. The transcriptome of nitrate-grown cells was compared to that of H. seropedicae grown in the presence of ammonium. Out of 4804 genes, 1619 were differentially expressed, 377 of which were induced and 1242 repressed. The putative narGHJI operon were amongst the most upregulated genes. Genes encoding the putative assimilatory nitrate reductase were also induced. In the second approach, â-galactosidase assays were used to study the regulation of the narXL, narK1UGHJImoaA and nasFED operons. The expression of narXL and narK1UGHJImoaA operons was induced in low level of oxygen by Fnr, but the latter operon is also induced on nitrate. The expression of nasFED operon was induced on nitrate and on nitrogen-limiting condition by NtrB/NtrC and NtrY/NtrX. Finally, in the third approach, knockout strains containing in-frame mutant nasA and narG of H. seropedicae were constructed and characterized. When these strains were grown on nitrate as nitrogen source, the narG- mutant showed a delay in growth whereas the nasA- mutant was not able to grow. The results suggest that the assimilatory nitrate reductase is essential for assimilation of nitrate, but the role of the respiratory nitrate reductase is still unclear

Regulação dos genes relacionados ao metabolismo de nitrato em Herbaspirillum seropedicae

Orientador : Profª. Drª. Leda Satie ChubatsuCoorientador : Prof. Dr. Emanuel Maltempi de SouzaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 18/03/2016Inclui referências : f. 53-56;92-94;125-127;148-152Resumo: H. seropedicae, membro das p-proteobactérias, é um diazotrofo capaz de colonizar tecidos internos de gramíneas de interesse comercial, como trigo, milho e cana-de-açúcar. O processo de fixação de nitrogênio desta bactéria é bem estudado. Entretanto, embora o nitrato seja a principal fonte de nitrogênio inorgânico encontrado nos solos, o metabolismo deste composto em H. seropedicae ainda não é bem conhecido. Análises in silico sugerem que H. seropedicae apresenta genes codificando para duas enzimas que metabolizam nitrato: nitrato redutase assimilatória (NAS) (genes HSERO_RS14545nasA) e nitrato redutase respiratória (NAR) (genes narGHI). Além disso, H. seropedicae apresenta genes codificando os membros dos sistemas de dois componentes, NtrB/NtrC e NtrY/NtrX e mutantes ntrC e ntrY não crescem em nitrato como fonte única de nitrogênio, sugerindo que estes sistemas são importantes para regular genes do metabolismo de nitrato. Face ao exposto, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar a função das nitrato redutases nAs e NAR de H. seropedicae, e entender a função dos sistemas NtrB/NtrC e NtrY/NtrX na regulação de genes acessórios envolvidos no metabolismo do nitrato. A caracterização fisiológica de um mutante na subunidade catalítica de NAS (mutante nasA) mostra que esta enzima é a principal forma de H. seropedicae assimilar nitrato. Por outro lado, a caracterização de um mutante na subunidade catalítica de NAR (mutante narG) sugere que esta enzima não é requerida para assimilar ou respirar nitrato. Entretanto, nAr está envolvida na produção de altas quantidades de nitrito, como também na produção de óxido nítrico. Finalmente, NAR parece ser importante para interação planta-bactéria possivelmente por produzir óxido nítrico. Os sistemas NtrY/NtrX e NtrB/NtrC são requeridos para ativar a transcrição do operon que dirige a transcrição dos genes que codificam NAS, razão pela qual os mutantes ntrY e ntrC não crescem em nitrato como fonte única de nitrogênio. Caracterizações in vitro da proteína NtrX mostraram que esta proteína é dimérica e que se liga diretamente a região promotora de narXL, que codifica um par de genes regulatórios relacionados ao metabolismo de nitrato. Análises de "footprinting" com DNase I permitiram a delimitação de uma provável região de ligação de NtrX na região promotora de narXL. Análises do transcriptoma global de um mutante ntrC por RNA-seq sugerem que o sistema NtrB/NtrC é o regulador chave de H. seropedicae em resposta a baixas concentrações de nitrogênio fixado, ativando genes cujos produtos estão envolvidos na recuperação de amônio, e reprimindo genes cujos produtos estão envolvidos no metabolismo energético, além de ativar genes do metabolismo de nitrato, incluindo os genes codificam para transportadores de nitrato (genes nasFED), e para NAS (genes HSERO_RS14545nasA). Palavras-chave: Herbaspirillum seropedicae. Metabolismo de nitrato. Nitrato redutase assimilatória. Nitrato redutase respiratória.Abstract: H. seropedicae, a member of the p-proteobacteria, is a diazotroph that colonizes the internal tissues of crops of economic importance, such as wheat, maize and sugar cane. The nitrogen-fixing process of this bacterium is well known. However, although nitrate is the main inorganic nitrogen source found in soils, the metabolism of this compound in H. seropedicae is not well known. In silico analyses suggest that H. seropedicae presents genes coding for two enzymes that metabolize nitrate: the assimilatory nitrate redutase (NAS) (HSERO_RS14545nasA genes) and the respiratory nitrate redutase (NAR) (narGHI genes,). Additionally, H. seropedicae presents genes coding for the members of the two component system, NtrB/NtrC and NtrY/NtrX, and ntrC and ntrY mutants cannot grow on nitrate as the sole nitrogen source, suggesting that these systems are important to regulate genes of nitrate metabolism. Given that, the aim of this study was to evaluate the function of the nitrate reductases NAS and NAR of H. seropedicae, and to understand the function of the NtrB/NtrC and NtrY/NtrX systems in the regulation of accessory genes related to nitrate metabolism. Physiological characterization of a knock-out mutant for the catalytic subunit of NAS (nasA mutant) shows that it is the main enzyme required to assimilate nitrate. On the other hand, the characterization of a mutant for the catalytic subunit of NAR (narG mutant) suggests that this enzyme is not required to assimilate or respire nitrate. However, NAR is involved in the production of high levels of nitrite, and also in the prodution of nitric oxide. Finally, NAR seems to be important for plant- bacteria interaction probably for producing nitric oxide. The NtrY/NtrX and NtrB/NtrC systems are required to activate the operon that drives the trancription of genes coding for NAS and probably this is the reason the ntrY and ntrC mutants cannot grow using nitrate as the only nitrogen source. In vitro characterization of NtrX protein showed that this protein is dimeric and binds directly to narXL promoter, which drives the transcription of genes related to nitrate metabolism. DNase I footprinting narrowed a putative NtrX binding site in the promoter region of narXL. RNA-seq analyses with ntrC mutant suggest that the NtrB/NtrC system is the master regulator of H. seropedicae in response to low levels of fixed nitrogen by activating genes whose products are involved with ammonium scavenging, and repressing genes whose products are involved with energy metabolism. Besides, this system is important to activate genes of nitrate metabolism, including the genes coding for nitrate transportes (nasFED genes), and for NAS (HSERO_RS14545nasA genes). Key words: Herbaspirillum seropedicae. Nitrate metabolism. Assimilatory nitrate reductase. Respiratory nitrate reductase

Regulação dos genes relacionados ao metabolismo de nitrato em Herbaspirillum seropedicae

Orientador: Profª Drª Leda Satie ChubatsuCoorientador: Prof. Dr. Emanuel Maltempi de SouzaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa: Curitiba, 18/03/2016Inclui referênciasResumo: H. seropedicae, membro das p-proteobactérias, é um diazotrofo capaz de colonizar tecidos internos de gramíneas de interesse comercial, como trigo, milho e cana-de-açúcar. O processo de fixação de nitrogênio desta bactéria é bem estudado. Entretanto, embora o nitrato seja a principal fonte de nitrogênio inorgânico encontrado nos solos, o metabolismo deste composto em H. seropedicae ainda não é bem conhecido. Análises in silico sugerem que H. seropedicae apresenta genes codificando para duas enzimas que metabolizam nitrato: nitrato redutase assimilatória (NAS) (genes HSERO_RS14545nasA) e nitrato redutase respiratória (NAR) (genes narGHI). Além disso, H. seropedicae apresenta genes codificando os membros dos sistemas de dois componentes, NtrB/NtrC e NtrY/NtrX e mutantes ntrC e ntrY não crescem em nitrato como fonte única de nitrogênio, sugerindo que estes sistemas são importantes para regular genes do metabolismo de nitrato. Face ao exposto, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar a função das nitrato redutases nAs e NAR de H. seropedicae, e entender a função dos sistemas NtrB/NtrC e NtrY/NtrX na regulação de genes acessórios envolvidos no metabolismo do nitrato. A caracterização fisiológica de um mutante na subunidade catalítica de NAS (mutante nasA) mostra que esta enzima é a principal forma de H. seropedicae assimilar nitrato. Por outro lado, a caracterização de um mutante na subunidade catalítica de NAR (mutante narG) sugere que esta enzima não é requerida para assimilar ou respirar nitrato. Entretanto, nAr está envolvida na produção de altas quantidades de nitrito, como também na produção de óxido nítrico. Finalmente, NAR parece ser importante para interação planta-bactéria possivelmente por produzir óxido nítrico. Os sistemas NtrY/NtrX e NtrB/NtrC são requeridos para ativar a transcrição do operon que dirige a transcrição dos genes que codificam NAS, razão pela qual os mutantes ntrY e ntrC não crescem em nitrato como fonte única de nitrogênio. Caracterizações in vitro da proteína NtrX mostraram que esta proteína é dimérica e que se liga diretamente a região promotora de narXL, que codifica um par de genes regulatórios relacionados ao metabolismo de nitrato. Análises de "footprinting" com DNase I permitiram a delimitação de uma provável região de ligação de NtrX na região promotora de narXL. Análises do transcriptoma global de um mutante ntrC por RNA-seq sugerem que o sistema NtrB/NtrC é o regulador chave de H. seropedicae em resposta a baixas concentrações de nitrogênio fixado, ativando genes cujos produtos estão envolvidos na recuperação de amônio, e reprimindo genes cujos produtos estão envolvidos no metabolismo energético, além de ativar genes do metabolismo de nitrato, incluindo os genes codificam para transportadores de nitrato (genes nasFED), e para NAS (genes HSERO_RS14545nasA). Palavras-chave: Herbaspirillum seropedicae. Metabolismo de nitrato. Nitrato redutase assimilatória. Nitrato redutase respiratória.Abstract: H. seropedicae, a member of the p-proteobacteria, is a diazotroph that colonizes the internal tissues of crops of economic importance, such as wheat, maize and sugar cane. The nitrogen-fixing process of this bacterium is well known. However, although nitrate is the main inorganic nitrogen source found in soils, the metabolism of this compound in H. seropedicae is not well known. In silico analyses suggest that H. seropedicae presents genes coding for two enzymes that metabolize nitrate: the assimilatory nitrate redutase (NAS) (HSERO_RS14545nasA genes) and the respiratory nitrate redutase (NAR) (narGHI genes,). Additionally, H. seropedicae presents genes coding for the members of the two component system, NtrB/NtrC and NtrY/NtrX, and ntrC and ntrY mutants cannot grow on nitrate as the sole nitrogen source, suggesting that these systems are important to regulate genes of nitrate metabolism. Given that, the aim of this study was to evaluate the function of the nitrate reductases NAS and NAR of H. seropedicae, and to understand the function of the NtrB/NtrC and NtrY/NtrX systems in the regulation of accessory genes related to nitrate metabolism. Physiological characterization of a knock-out mutant for the catalytic subunit of NAS (nasA mutant) shows that it is the main enzyme required to assimilate nitrate. On the other hand, the characterization of a mutant for the catalytic subunit of NAR (narG mutant) suggests that this enzyme is not required to assimilate or respire nitrate. However, NAR is involved in the production of high levels of nitrite, and also in the prodution of nitric oxide. Finally, NAR seems to be important for plant- bacteria interaction probably for producing nitric oxide. The NtrY/NtrX and NtrB/NtrC systems are required to activate the operon that drives the trancription of genes coding for NAS and probably this is the reason the ntrY and ntrC mutants cannot grow using nitrate as the only nitrogen source. In vitro characterization of NtrX protein showed that this protein is dimeric and binds directly to narXL promoter, which drives the transcription of genes related to nitrate metabolism. DNase I footprinting narrowed a putative NtrX binding site in the promoter region of narXL. RNA-seq analyses with ntrC mutant suggest that the NtrB/NtrC system is the master regulator of H. seropedicae in response to low levels of fixed nitrogen by activating genes whose products are involved with ammonium scavenging, and repressing genes whose products are involved with energy metabolism. Besides, this system is important to activate genes of nitrate metabolism, including the genes coding for nitrate transportes (nasFED genes), and for NAS (HSERO_RS14545nasA genes). Key words: Herbaspirillum seropedicae. Nitrate metabolism. Assimilatory nitrate reductase. Respiratory nitrate reductase

Genes do metabolismo de nitrato em Herbaspirillum Seropedicae : regulação transcricional em análise funcional

Orientadora : Profa. Dra. Liu Un RigoCo-orientadora : Profa. Dra. Roseli WassemDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 16/02/2012Bibliografia: fls. 94-101Resumo: Herbaspirillum seropedicae, membro do grupo ?-proteobactérias, é uma bactéria fixadora de nitrogênio e endofítica que se associa com gramíneas de interesse comercial. Além de apresentar genes envolvidos com a fixação de nitrogênio, este microrganismo também apresenta vários genes envolvidos com o metabolismo de nitrato. Entre estes últimos, estão os genes que codificam para prováveis nitrato redutase assimilatória (nasA e Hsero_2899) e nitrato redutase respiratória (narGHJI). Entretanto, o papel desta última enzima em H. seropedicae não é conhecido, uma vez que este microrganismo não é capaz de crescer em anaerobiose utilizando nitrato como fonte única de nitrogênio. Além de conter genes que codificam para prováveis nitrato redutases, H. seropedicae também contém genes que codificam para prováveis transportadores de nitrato (narK, narK1U e nasFED) e proteínas regulatórias (nasR e narXL). A regulação transcricional de vários destes genes já foi estudada anteriormente, no entanto, ela ainda não é completamente entendida. Desse modo, com o intuito de melhor compreender a regulação de genes envolvidos com o metabolismo de nitrato em H. seropedicae e entender quais são os papéis das nitrato redutases deste microrganismo, neste trabalho foram utilizadas três abordagens. Primeiramente, RNA total a partir de H. seropedicae estirpe SmR1 crescido em nitrato como fonte única de nitrogênio foi extraído, depletado de rRNA e usado para análise transcricional através de RNAseq, em plataforma SOLiD. O transcriptoma de células crescidas em nitrato foi comparado com transcriptoma de H. seropedicae crescido na presença de amônio. De um total de 4804 genes, 1619 estavam diferencialmente expressos, 377 dos quais estavam induzidos e 1242 reprimidos. Os genes narGHI estão entre os genes mais induzidos em nitrato. Os genes que codificam para a provável nitrato redutase assimilatória também estavam induzidos. Na segunda abordagem, ensaios de ?-galactosidase foram utilizados para estudar a regulação dos operons narXL, narK1UGHJImoaA e nasFED. A expressão dos operons narXL e narK1UGHJImoaA foi induzida em baixo nível de oxigenação por Fnr. A expressão do último operon também foi induzida por nitrato. A expressão do operon nasFED foi induzida por nitrato e em condições limitantes de nitrogênio através das proteínas membros do sistemas de dois componentes NtrB/NtrC e NtrY/NtrX. Finalmente, na terceira abordagem, estirpes mutantes nasA e narG de H. seropedicae foram construídas e caracterizadas. Quando estas estirpes foram cultivadas em nitrato como fonte de nitrogênio, o mutante narG- mostrou um crescimento mais lento em relação a estirpe selvagem, enquanto que o mutante nasA- não foi capaz de crescer. Os resultados sugerem que a nitrato redutase assimilatória é essencial para assimilação de nitrato, mas o papel da nitrato redutase respiratória ainda não é conhecido.Abstract: Herbaspirillum seropedicae is an endophytic nitrogen-fixing bacterium that associates with gramineous plants of economic importance. In addition to genes involved with nitrogen fixation, this microorganism also contains some genes involved with nitrate metabolism, including genes encoding a putative assimilatory (nasA e Hsero_2899) and a respiratory nitrate reductase (narGHJI). However, the role of the latter enzyme in H. seropedicae is unknown because this microrganism is not capable to grow in anaerobiosis using nitrate as the only nitrogen source. In addition to the nitrate reductases, this organism also contains genes that encode to putative nitrate transporters (narK, narK1U e nasFED) and regulatory proteins (nasR e narXL). Some of these genes were studied before; however, the regulation and function of them in H. seropedicae are not completely understood. In order to understand how some of the genes related to nitrate metabolism are regulated and the roles of the nitrate reductases, it was used three approaches. First, total RNA from the H. seropedicae strain SmR1 grown on nitrate as the sole nitrogen source was extracted, depleted of rRNA and used for RNAseq transcriptional profiling on a plataform SOLiD 4. The transcriptome of nitrate-grown cells was compared to that of H. seropedicae grown in the presence of ammonium. Out of 4804 genes, 1619 were differentially expressed, 377 of which were induced and 1242 repressed. The putative narGHJI operon were amongst the most upregulated genes. Genes encoding the putative assimilatory nitrate reductase were also induced. In the second approach, â-galactosidase assays were used to study the regulation of the narXL, narK1UGHJImoaA and nasFED operons. The expression of narXL and narK1UGHJImoaA operons was induced in low level of oxygen by Fnr, but the latter operon is also induced on nitrate. The expression of nasFED operon was induced on nitrate and on nitrogen-limiting condition by NtrB/NtrC and NtrY/NtrX. Finally, in the third approach, knockout strains containing in-frame mutant nasA and narG of H. seropedicae were constructed and characterized. When these strains were grown on nitrate as nitrogen source, the narG- mutant showed a delay in growth whereas the nasA- mutant was not able to grow. The results suggest that the assimilatory nitrate reductase is essential for assimilation of nitrate, but the role of the respiratory nitrate reductase is still unclear

The NtrY–NtrX two-component system is involved in controlling nitrate assimilation in Herbaspirillum seropedicae strain SmR1

Submitted by Luciane Willcox ([email protected]) on 2016-10-13T16:59:29Z No. of bitstreams: 1 The NtrY–NtrX two-component system.pdf: 919572 bytes, checksum: 2fa21e44abff448bcff5c6989d5353bd (MD5)Approved for entry into archive by Luciane Willcox ([email protected]) on 2016-10-13T17:17:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 The NtrY–NtrX two-component system.pdf: 919572 bytes, checksum: 2fa21e44abff448bcff5c6989d5353bd (MD5)Made available in DSpace on 2016-10-13T17:17:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 The NtrY–NtrX two-component system.pdf: 919572 bytes, checksum: 2fa21e44abff448bcff5c6989d5353bd (MD5) Previous issue date: 2016-09-16INCT-Fixação Biologica de Nitrogênio/CNPq/MCTI, CNPq, CAPES, Fundação Araucaria, Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L011468/1).Department of Biochemistry and Molecular Biology. Universidade Federal do Paraná. Curitiba, PR, Brasil.Department of Biochemistry and Molecular Biology. Universidade Federal do Paraná. Curitiba, PR, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.Department of Biochemistry and Molecular Biology. Universidade Federal do Paraná. Curitiba, PR, Brasil.Department of Biochemistry and Molecular Biology. Universidade Federal do Paraná. Curitiba, PR, Brasil.Department of Biochemistry and Molecular Biology. Universidade Federal do Paraná. Curitiba, PR, Brasil.Department of Biochemistry and Molecular Biology. Universidade Federal do Paraná. Curitiba, PR, Brasil.Department of Life Sciences, Imperial College London, UKDepartment of Life Sciences, Imperial College London, UKDepartment of Life Sciences, Imperial College London, UKUniversidade Federal do Paraná. Department of Genetics. Curitiba, PR, Brasil.Department of Biochemistry and Molecular Biology. Universidade Federal do Paraná. Curitiba, PR, Brasil.Herbaspirillum seropedicae is a diazotrophic β-Proteobacterium found endophytically associated with gramineae (Poaceae or graminaceous plants) such as rice, sorghum and sugar cane. In this work we show that nitrate-dependent growth in this organism is regulated by the master nitrogen regulatory two-component system NtrB-NtrC, and by NtrY-NtrX, which functions to specifically regulate nitrate metabolism. NtrY is a histidine kinase sensor protein predicted to be associated with the membrane and NtrX is the response regulator partner. The ntrYntrX genes are widely distributed in Proteobacteria. In α-Proteobacteria they are frequently located downstream from ntrBC, whereas in β-Proteobacteria these genes are located downstream from genes encoding an RNA methyltransferase and a proline-rich protein with unknown function. The NtrX protein of α-Proteobacteria has an AAA+ domain, absent in those from β-Proteobacteria. An ntrY mutant of H. seropedicae showed the wild-type nitrogen fixation phenotype, but the nitrate-dependent growth was abolished. Gene fusion assays indicated that NtrY is involved in the expression of genes coding for the assimilatory nitrate reductase as well as the nitrate-responsive two-component system NarX-NarL (narK and narX promoters, respectively). The purified NtrX protein was capable of binding the narK and narX promoters, and the binding site at the narX promoter for the NtrX protein was determined by DNA footprinting. In silico analyses revealed similar sequences in other promoter regions of H. seropedicae that are related to nitrate assimilation, supporting the role of the NtrY-NtrX system in regulating nitrate metabolism in H. seropedicae

Effects on gene expression during maize-Azospirillum interaction in the presence of a plant-specific inhibitor of indole-3-acetic acid production

Abstract Amongst the sustainable alternatives to increase maize production is the use of plant growth-promoting bacteria (PGPB). Azospirillum brasilense is one of the most well-known PGPB being able to fix nitrogen and produce phytohormones, especially indole-3-acetic acid - IAA. This work investigated if there is any contribution of the bacterium to the plant’s IAA levels, and how it affects the plant. To inhibit plant IAA production, yucasin, an inhibitor of the TAM/YUC pathway, was applied. Plantlets’ IAA concentration was evaluated through HPLC and dual RNA-Seq was used to analyze gene expression. Statistical differences between the group treated with yucasin and the other groups showed that A. brasilense inoculation was able to prevent the phenotype caused by yucasin concerning the number of lateral roots. Genes involved in the auxin and ABA response pathways, auxin efflux transport, and the cell cycle were regulated by the presence of the bacterium, yucasin, or both. Genes involved in the response to biotic/abiotic stress, plant disease resistance, and a D-type cellulose synthase changed their expression pattern among two sets of comparisons in which A. brasilense acted as treatment. The results suggest that A. brasilense interferes with the expression of many maize genes through an IAA-independent pathway