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Evaluación de la genotoxicidad inducida por agentes mutagénicos mediante el ensayo cometa
Los agentes mutagénicos son los principales causantes de daños al ADN, precursores de mutaciones ocasionando errores en las funciones de la célula, por esta razón se busca estandarizar el protocolo modificado de ensayo cometa. Adicionalmente, se utilizan las enzimas de reparación FPG y ENDO III para identificar el tipo de daño oxidativo en la célula al ser inducidas por agentes como: peróxido de hidrógeno (H2O2), luz ultravioleta (UV) y bromato de potasio (KBrO3).
El trabajo consiste en el aislamiento de linfocitos a partir de sangre periférica con el uso de un gradiente de densidad, Ficoll. Se realiza una lisis celular que permite la liberación del ADN, seguido de un proceso de alcalinización y una electroforesis de células individuales permitiendo la migración por carga del material genético. Posteriormente, se realiza una tinción con el colorante fluorescente de ADN, DAPI y se visualiza en un microscopio de fluorescencia con el filtro correspondiente, se identifica por medio de una lámpara de mercurio a una longitud de onda 590 nm la formación de una cola o cometa, con el propósito de evaluar el grado de daño existente en el ADN. Se emplean controles negativos, positivos y con tratamiento enzimático. Los valores registrados indican el porcentaje de daño existente en las células. Se analiza las imágenes en un software de calificación automático de los cometas.
En el presente trabajo de investigación se evaluó el daño en el ADN causado por los diversos agentes mutagénicos mediante el uso de ensayo cometa en células mononucleares de sangre periférica humana. Dicha técnica es un método de alta sensibilidad y especificidad para el análisis de xenobióticos. Mediante el análisis de ensayo cometa con enzima FPG, los resultados demuestran que la inducción de daño al ADN a mutagénicos estudiados es principalmente de carácter oxidativo. Siendo el agente más dañino el bromato de potasio (KBrO3), seguido de la luz ultravioleta (UV) y el menor daño, el peróxido de hidrogeno (H2O2).Mutagenic agents are the main causes of DNA damage, precursors of mutations causing errors in cell functions, for this reason the modified comet test protocol is sought to be standardized. Additionally, the repair enzymes FPG and ENDO III are used to identify the type of oxidative damage in the cell when induced by agents such as: hydrogen peroxide (H2O2), ultraviolet light (UV) and potassium bromate (KBrO3).
The work consists of the isolation of lymphocytes from peripheral blood with the use of a density gradient, Ficoll. A cell lysis is carried out that allows the release of the DNA, followed by an alkalinization process and an electrophoresis of individual cells allowing the migration by charge of the genetic material. Subsequently, staining with the fluorescent DNA dye, DAPI, is performed and visualized in a fluorescence microscope with the corresponding filter, the formation of a tail or comet is identified by means of a mercury lamp at a wavelength of 590 nm, with the purpose of evaluating the degree of existing damage to the DNA. Negative, positive and enzyme-treated controls are used. The recorded values indicate the percentage of damage existing in the cells. The images are analyzed in automatic comet scoring software.
In the present research work, the DNA damage caused by the various mutagenic agents was evaluated using the comet assay in human peripheral blood mononuclear cells. Said technique is a method of high sensitivity and specificity for the analysis of xenobiotics. Through the comet assay analysis with ENDO III and FPG enzyme, the results show that the induction of DNA damage to the mutagenic studied is mainly oxidative. The most harmful agent being potassium bromate (KBrO3), followed by ultraviolet light (UV) and the least damage, hydrogen peroxide (H2O2)