Действие противовирусных миРНК на выработку цитокинов in vitro

Objectives. To evaluate the dynamics of the expression level of IL-1β and IL-28β (IFN-λ3) genes as a result of complex knockdown of some cellular genes, whose expression products play an important role in the reproduction of the influenza virus.Methods. Following the collection of virus-containing liquid and cell lysate within three days from the moment of transfection and infection, the intensity of viral reproduction was assessed using the cytopathic effect titration method. The concentration of viral ribonucleic acid (vRNA) and change in the expression of IL-1β and IL-28β (IFN-λ3) were determined by real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (real-time RT-qPCR). The nonparametric Mann–Whitney test was used to statistically calculate significant differences between groups.Results. The use of each small interfering ribonucleic acid (siRNA) complex led to a decrease in viral reproduction on the first day at the multiplicity of infection (MOI) of 0.001. The use of complex A (FLT4.2 + Nup98.1) and D (FLT4.2 + Nup98.1 + Nup205) led to a decrease in viral titer by 2.8 lgTCID50/mL and by 2.1 lgTCID50/mL relative to the use of nonspecific L2 siRNA and viral control (p ≤ 0.05). Transfection of complexes B (Nup98.1 + Nup205) and C (FLT4.2 + Nup205) also reduced the viral titer by 1.5 lgTCID50/mL and 1.8 lgTCID50/mL relative to nonspecific L2 siRNA and viral control (p ≤ 0.05). When conducting real-time RT-qPCR, a significant decrease in the concentration of viral RNA was also noted. When using complexes B, C, and D, the concentration of vRNA decreased on the first day by 14.5, 4.1, and 15 times, respectively. On the second day, a decrease in vRNA was observed in cells with B and D complexes by 17.1 and 18.3 times (p ≤ 0.05). Along with a decrease in the viral titer and vRNA, an increase in the expression of the IL-1β and IL-28β genes was observed on the first day when using all siRNA complexes relative to nonspecific and viral controls (p ≤ 0.05). On the second day, an increase was also observed in cells with A and D complexes, while on the third day, there was an increase in the expression of these genes in cells with complex D (p ≤ 0.05).Conclusions. The use of siRNA complexes is shown to have a pronounced antiviral effect while simultaneously suppressing the activity of cellular genes (FLT4, Nup98 and Nup205). In parallel, the transfection of complexes that block the formation of expression products necessary for viral reproduction is demonstrated to lead to an increase in the level of expression of the IL-1β and IL-28β genes. These results indicate not only that the use of siRNA has antiviral activity, but also immunomodulatory activity, which can contribute to a more effective immune response of the body.Цели. Оценить динамику уровня экспрессии генов IL-1β и IL-28β (IFN-λ3) в результате комплексного нокдауна некоторых клеточных генов, чьи продукты экспрессии играют важную роль в репродукции вируса гриппа.Методы. Вируссодержащую жидкость и клеточный лизат отбирали в течение 3-х дней с момента трансфекции и заражения и оценивали интенсивность вирусной репродукции методами титрования по цитопатическому действию. Концентрацию вирусной рибонуклеиновой кислоты (вРНК) и изменение экспрессии IL-1β и IL-28β (IFN-λ3) определяли методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ). Для вычисления статистически значимых различий между группами использовали непараметрический критерий Манна-Уитни.Результаты. Использование каждого комплекса малых интерферирующих РНК (миРНК) приводило к снижению вирусной репродукции на 1-е сутки при множественности заражения 0.001. Применение комплексов A (FLT4.2 + Nup98.1) и D (FLT4.2 + Nup98.1 + Nup205) приводило к снижению вирусного титра на 2.8 lgТЦД50/мл и на 2.1 lgТЦД50/мл относительно применения неспецифической миРНК L2 и вирусного контроля (р ≤ 0.05). результате трансфекции комплексов B (Nup98.1 + Nup205) и C (FLT4.2 + Nup205) вирусный титр также снижался на 1.5 lgТЦД50/мл и 1.8 lgТЦД50/мл соответственно относительно неспецифической миРНК L2 и вирусного контроля (р ≤ 0.05). При проведении ОТ-ПЦР-РВ также было отмечено достоверное уменьшение концентрации вРНК. При использовании комплексов B, C и D концентрация вРНК снижалась на 1-е сутки в 14.5, 4.1 и 15.0 раз соответственно. На 2-е сутки в клетках с комплексами B и D наблюдалось уменьшение концентрации вРНК в 17.1 и 18.3 раз (р ≤ 0.05). Наряду со снижением вирусного титра и вРНК наблюдалось повышение экспрессии генов IL-1β и IL-28β на 1-е сутки при использовании всех комплексов миРНК относительно неспецифического и вирусного контроля (р ≤ 0.05). На 2-е сутки также наблюдалось повышение экспрессии в клетках с комплексами A и D, а на третьи – в клетках с комплексом D (р ≤0.05).Выводы. Исследование показало, что применение комплексов миРНК приводит к выраженному противовирусному эффекту при одновременном подавлении активности клеточных генов (FLT4, Nup98 и Nup205). Параллельно с этим было выявлено, что при трансфекции комплексов, блокирующих образование продуктов экспрессии, необходимых для вирусной репродукции, повышается уровень экспрессии генов IL-1β и IL-28β. Данные результаты свидетельствуют о том, что используемые миРНК обладают не только противовирусной, но также и иммуномодулирующей активностью, что способствует более эффективному иммунному ответу организма

Микро-РНК у реципиентов легких: перспективы клинического применения

This review summarizes the current literature devoted to the analysis of diagnostic role of biomarkers in rejection of the transplanted lung. Numerous researches have focused on small non-coding RNAs (micro-RNA) that regulate gene expression and affect various cell functions. Variations in the concentration of different micro-RNA have been shown in some pathological processes, including rejection of solid organs. Probably, measuring the level of micro-RNA in lung transplant may have value in the assessment of risk of rejection and possibility of minimizing immunosuppressive therapy. The accumulation of clinical data on the correlation of profiles of various biomarkers with clinical and laboratory parameters in lung recipients will help in finding non-invasive methods for the diagnosis rejection and improving long-term results of transplantation.Обзор литературы посвящен исследованиям биомаркеров, потенциально пригодных для диагностики отторжения трансплантированных легких. В настоящее время большой интерес вызывает изучение малых некодирующих РНК (микро-РНК), регулирующих экспрессию генов и влияющих на различные функции клетки. Были показаны изменения концентрации некоторых микро-РНК при различных патологических процессах, в том числе при отторжении солидных органов. Оценка уровней микро-РНК при трансплантации легких может иметь значение для оценки риска развития отторжения и подбора иммуносупрессивной терапии. Накопление клинических данных о связи профилей различных биомаркеров с клиническими и лабораторными показателями у реципиентов легких поможет в поиске неинвазивных методов диагностики отторжения и улучшении отдаленных результатов трансплантации

Исследование противогриппозной активности комплексов миРНК против клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205 на модели in vitro

Objectives. Evaluation of changes in the viral activity of influenza A/WSN/33 after complex knockdown of combinations of cellular genes FLT4, Nup98 and Nup205 in human lung cell culture A549. Methods. The work was carried out using the equipment of the Center for Collective Use of the I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Russia. The authors performed transfection of combinations of small interfering ribonucleic acid (siRNA) complexes that cause simultaneous disruption of the expression of cellular genes FLT4, Nup98, and Nup205. Within three days from the moment of transfection and infection, the supernatant fluid and cell lysate were taken for subsequent viral reproduction intensity determination using the titration method for cytopathic action. The dynamics of changes in the concentration of viral ribonucleic acid (vRNA) was determined by real-time reverse transcription polymerase chain reaction (real-time RT-PCR). The nonparametric Mann–Whitney test was used to calculate statistically significant differences between groups.Results. Using all of the combinations of siRNA complexes, cell viability did not decrease below the threshold level of 70%. In cells treated with complex FLT4.2 + Nup98.1 + Nup205 at the multiplicity of infection (MOI) equal to 0.1, a significant decrease in viral reproduction by 1.5 lg was noted on the first day in relation to nonspecific and viral controls. The use of siRNA complexes at MOI 0.01 resulted in a more pronounced antiviral effect. The viral titer in cells treated with siRNA complexes FLT4.2 + Nup98.1 and Nup98.1 + Nup205 decreased by 1.5 lg on the first day. In cells treated with complexes FLT4.2 + Nup205 and FLT4.2 + Nup98.1 + Nup205, it decreased by 1.8 and 2.0 lg on the first day and by 1.8 and 2.5 lg on the second day, respectively, in relation to nonspecific and viral controls. When conducting real-time RT-PCR, a significant decrease in the concentration of vRNA was noted. At MOI 0.1, a 295, 55, and 63-fold decrease in the viral load was observed with the use of siRNA complexes FLT4.2 + Nup98.1, Nup98.1 + Nup205, and FLT4.2 + Nup98.1 + Nup205, respectively. On the second day, a decrease in vRNA was also observed in cells treated with complex A. A 415-fold decrease in vRNA on the third day was noted in cells treated with complex FLT4.2 + Nup205. At MOI 0.01, the concentration of vRNA decreased 9.5 times when using complex B relative to nonspecific and viral control.Conclusions. The study showed a pronounced antiviral effect of siRNA combinations while simultaneously suppressing the activity of cellular genes (FLT4, Nup98, and Nup205), whose expression products are playing important role in the viral reproduction process, and obtained original designs of siRNA complexes. The results obtained are of great importance for the creation of emergence prophylactic and therapeutic drugs, whose action is based on the mechanism of RNA interference.Цели. Оценка изменения вирусной активности гриппа A/WSN/33 после комплексного нокдауна комбинаций клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205 в культуре легочных кле­ток человека А549.Методы. Работа выполнена с использованием оборудования центра коллективного поль­зования Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им И.И. Мечникова (Россия). Авторами выполнялась трансфекция комбинаций комплексов миРНК, вызыва­ющих одновременное нарушение экспрессии клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205. В течение трех дней с момента трансфекции и заражения проводился отбор надосадоч­ной жидкости и клеточного лизата для последующего определения интенсивности ви­русной репродукции по методу титрования по цитопатическому действию. Динамику изменения концентрации вирусной рибонуклеиновой кислоты (вРНК) определяли мето­дом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального вре­мени (ОТ-ПЦР-РВ). Для вычисления статистически значимых различий между группами использовали непараметрический критерий Манна-Уитни.Результаты. При использовании всех комбинаций комплексов малых интерферирую­щих РНК (миРНК) жизнеспособность клеток не снижалась ниже порогового уровня в 70%. В клетках, обработанных комплексом FLT4.2 + Nup98.1 + Nup205 при множественности заражения (Multiplicity of infection, MOI) 0.1 достоверное снижение вирусной репродукции на 1.5 lg отмечалось на первые сутки по отношению к неспецифическому и вирусному контролям. Использование комплексов миРНК при MOI 0.01 приводило к более выражен­ному противовирусному эффекту. Вирусный титр в клетках, обработанных комплек­сами миРНК FLT4.2 + Nup98.1 и Nup98.1 + Nup205 снижался на первые сутки на 1.5 lg. В клетках, обработанных комплексами FLT4.2 + Nup205 и FLT4.2 + Nup98.1 + Nup205 снижался на 1.8 и 2 lg на первые сутки и на 1.8 и 2.5 lg на вторые сутки соответствен­но по отношению к неспецифическому и вирусному контролям. При проведении ОТ-ПЦР-РВ отмечено достоверное снижение концентрации вирусной РНК. При MOI 0.1 снижение ви­русной в 295, 55 и 63 раза отмечался при использовании комплексов миРНК FLT4.2 + Nup98.1, Nup98.1 + Nup205 и FLT4.2 + Nup98.1 + Nup205 соответственно. На вторые сутки сниже­ние вирусной РНК также отмечалось в клетках, обработанных комплексом FLT4.2 + Nup98.1. Снижение вРНК на третьи сутки в 415 раз отмечалось в клетках, обработанных ком­плексом FLT4.2 + Nup205. При MOI 0.01 концентрация вРНК снизилась в 9.5 раз при ис­пользовании комплекса Nup98.1 + Nup205 относительно неспецифического и вирусного контроля.Выводы. В ходе исследования был показан выраженный противовирусный эффект ком­бинаций миРНК при одновременном подавлении активности клеточных генов (FLT4, Nup98 и Nup205), чьи продукты экспрессии играют важное участие в процессе вирусной репродукции, а также получены оригинальные конструкции комплексов миРНК. Полу­ченные результаты имеют важное значение для создания препаратов для экстренной профилактики и терапии, чье действие основано на механизме РНК-интерференции

Ex vivo перфузия донорских легких с использованием разработанного раствора с последующей ортотопичеcкой левосторонней трансплантацией легкого (экспериментальное исследование)

The continued unavailability of adequate organs for transplantation to meet the existing demand has resulted in a major challenge in transplantology. This is especially felt in lung transplantation (LTx). LTx is the only effective method of treatment for patients with end-stage lung diseases. Normothermic ex vivo lung perfusion (EVLP) has been proposed to increase the number of donor organs suitable for transplant – EVLP has proven itself in a number of clinical trials. The ability to restore suboptimal donor lungs, previously considered unsuitable for transplantation, can improve organ functionality, and thus increase the number of lung transplants. However, widespread implementation of ex vivo perfusion is associated with high financial costs for consumables and perfusate.Objective: to test the developed solution on an ex vivo lung perfusion model, followed by orthotopic LT under experimental conditions.Materials and methods. The experiment included lung explantation stages, static hypothermic storage, EVLP and orthotopic left LTx. Perfusion was performed in a closed perfusion system. We used our own made human albumin-based perfusion solution as perfusate. Perfusion lasted for 2 hours, and evaluation was carried out every 30 minutes. In all cases, static hypothermic storage after perfusion lasted for 4 hours. The orthotopic single-lung transplantation procedure was performed using assisted circulation, supplemented by membrane oxygenation. Postoperative follow-up was 2 hours, after which the experimental animal was euthanized.Results. Respiratory index before lung explantation was 310 ± 40 mmHg. The PaO2/FiO2 ratio had positive growth dynamics throughout the entire EVLP procedure. Oxygenation index was 437 ± 25 mm Hg after 120 minutes of perfusion. Throughout the entire EVLP procedure, there was a steady decrease in pulmonary vascular resistance (PVR). Initial PVR was 300 ± 100 dyn×s/cm5; throughout the EVLP, PVR tended to fall, reaching 38,5 ± 12 dyn×s/cm5 at the end of perfusion.Conclusion. A safe and effective EVLP using our perfusate is possible. The developed orthotopic left lung transplantation protocol under circulatory support conditions, supplemented by membrane oxygenation, showed it is efficient and reliable.На сегодняшний день в трансплантологии дефицит донорских органов остается главной проблемой. Особенно это ощущается в трансплантации легких. Трансплантация легких является единственным эффективным методом лечения пациентов с терминальными стадиями респираторной недостаточности. С целью расширения пула эффективных доноров предлагается технология нормотермической ex vivo перфузии, хорошо зарекомендовавшей себя в ряде клинических исследований. Возможность восстанавливать субоптимальные донорские легкие, считавшиеся ранее не пригодными для трансплантации, позволяет улучшить функциональные возможности органа и тем самым увеличить число трансплантаций легких. Однако широкое внедрение технологии ex vivo перфузии сопряжено с высокими финансовыми затратами на расходные материалы и перфузионный раствор.Цель: апробировать разработанный раствор на модели ex vivo перфузии донорских легких с последующей ортотопической трансплантацией легкого в условиях эксперимента.Материалы и методы. Эксперимент включал стадии эксплантации легких, статическое гипотермическое хранение, процедуру нормотермической ex vivo перфузии и ортотопическую левостороннюю трансплантацию. Перфузия проводилась в замкнутом контуре. В качестве перфузата использовали собственный перфузионный раствор на основе альбумина человека. Время перфузии составляло 2 часа, оценка проводилась каждые 30 минут. Период статического гипотермического хранения после перфузии составил 4 часа во всех наблюдениях. Процедуру ортотопической однолегочной трансплантации выполняли с применением вспомогательного кровообращения, дополненного мембранной оксигенацией. Период наблюдения в послеоперационном периоде составлял 2 часа, после чего проводилась эвтаназия экспериментального животного.Результаты. Показатель респираторного индекса до момента эксплантации донорских легких составлял 310 ± 40 мм рт. ст. На протяжении всей процедуры ex vivo перфузии отмечалась положительная динамика роста PaО2/FiO2. Спустя 120 минут перфузии индекс оксигенации составил 437 ± 25 мм рт. ст. Исходно показатель легочного сосудистого сопротивления (ЛСС) составлял 300 ± 100 Дин×с/см5, на протяжении всей ex vivo перфузии прослеживалась динамика к снижению показателя ЛСС; на окончание перфузии показатель ЛСС составил 38,5 ± 12 Дин×с/см5.Заключение. Экспериментальное исследование показало возможность проведения безопасной и эффективной процедуры нормотермической ex vivo перфузии с использованием отечественного перфузионного раствора. Разработанный протокол ортотопической трансплантации левого легкого в условиях вспомогательного кровообращения, дополненного мембранной оксигенацией, показал свою эффективность и надежность

Экспрессия микроРНК у реципиентов легких: корреляции с клиническими и лабораторными данными

Objective: to evaluate the expression levels of miRNA (miR-27, miR-101, miR-142, miR-339 and miR-424) and its relationship with clinical and laboratory parameters in lung transplant recipients. Materials and methods. The study included 57 lung recipients aged 10 to 74 years (35 ± 15), including six children (9%) – four boys 10, 12, 13 and 17 years and girls 13 and 14 years old – and 51 adult recipients, including 30 men (62.5%). The control group was made up of 14 healthy individuals that were not significantly different by gender and age. Expression levels of the microRNAs studied in blood plasma were determined via quantitative polymerase chain reaction (PCR). Correlations of miRNA expression levels with complete blood count and biochemical blood test indicators were analyzed. Results. Patients with end-stage chronic respiratory failure (potential lung recipients) were found to have significantly higher expression levels of miR-27, miR-101 and miR-339 in plasma than the healthy individuals (p = 0.02, p = 0.03 and p = 0.01, respectively). The expression level of miR-339 correlated with the age of potential lung recipients (p = 0.04). It was a negative correlation (r = –0.46). The expression levels of the other four miRNAs were age independent. The average expression level of miR-424 in lung recipients in the long-term period after lung transplant was higher than in waitlisted patients (p = 0.03). Analysis of the relationship between miRNA expression levels and external respiration function in the long-term post-transplant period showed that miR-142 expression level (r = 0.61; p = 0.04) positively correlates with the Tiffeneau-Pinelli index. This strong correlation, which exceeds 85%, indicates the presence of restrictive lung diseases. A year and more after transplantation, it was found that in the recipients, there were close positive correlations between miR-27, miR-142, miR-424 expression levels and blood leukocyte concentration, as well as between the miR-142 expression level and the sCD40L concentration during this period. Conclusion. A comparative study of the expression level of miRNAs (miR-27, miR-101, miR-142, miR-339 and miR-424) in the blood plasma of patients suffering from end-stage chronic lung diseases of various origin and in lung recipients enables us to conclude that further studies of the miRNA panels are needed in order to assess their effectiveness as potential molecular and genetic markers of post-transplant complications.Цель: оценить уровень экспрессии микроРНК (miR-27, miR-101, miR-142, miR-339 и miR-424) и ее связь с клиническими и лабораторными параметрами у реципиентов трансплантированных легких. Материалы и методы. В исследование включены 57 реципиентов легких в возрасте от 10 до 74 лет (в среднем 35 ± 15), среди которых шестеро детей (9%) – четыре мальчика 10, 12, 13 и 17 лет и девочки 13 и 14 лет – и 51 взрослый реципиент, в том числе 30 мужчин (62,5%). Группу сравнения составили 14 здоровых лиц, значимо не отличающихся по полу и возрасту. Уровни экспрессии исследуемых в плазме крови микроРНК определялись методом количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Осуществлялся анализ корреляционных связей уровней экспрессии микроРНК с основными показателями общего и биохимического анализов крови. Результаты. Установлены достоверно более высокие показатели экспрессии miR-27, miR-101 и miR-339 в плазме крови у пациентов с терминальной стадией хронической дыхательной недостаточности (потенциальных реципиентов легких) по сравнению со здоровыми лицами (р = 0,02, р = 0,03 и р = 0,01 соответственно). Экспрессия четырех из пяти не зависела от возраста. Уровень экспрессии miR-339 коррелировал с возрастом потенциальных реципиентов легких (p = 0,04), и связь носила обратный характер, r = –0,46. Средняя величина уровня экспрессии miR-424 у реципиентов легких в отдаленном периоде после ТЛ оказалась выше, чем у пациентов, ожидающих трансплантацию (р = 0,03). При изучении связи уровней экспрессии микроРНК с показателями функции внешнего дыхания в отдаленном посттрансплантационном периоде установлена достоверная прямая связь уровня экспрессии miR-142 (r = 0,61; p = 0,04) с индексом Тиффно, величина которого более 85% свидетельствует о рестриктивных нарушениях дыхательных путей. Через год и более после трансплантации у реципиентов выявлены тесные прямые корреляции уровней экспрессии miR-27, miR-142 и miR-424 с концентрацией лейкоцитов в крови, а также уровня экспрессии miR-142 с концентрацией sCD40L в этот период. Заключение. Сравнительное исследование уровня экспрессии микроРНК (miR-27, miR-101, miR-142, miR-339 и miR-424) в плазме крови пациентов, страдающих хроническими заболеваниями легких различной этиологии в терминальной стадии, и у реципиентов легких позволяет сделать заключение о целесообразности дальнейших исследований панели микроРНК для оценки их эффективности в качестве потенциальных молекулярно-генетических маркеров посттрансплантационных осложнений

Нокдаун клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205 как супрессор вирусной активности гриппа А/WSN/33 (H1N1) в культуре клеток А549

Objectives. To evaluate the effect of cellular genes FLT4, Nup98, and Nup205 on the reproduction of the influenza A virus in A549 human lung cancer cell line.Methods. The work was carried out using the equipment of the center for collective use of the I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera (Russia). The virus-containing fluid was collected within three days from the moment of transfection and infection and the intensity of viral reproduction was assessed by viral titration and hemagglutination reaction. The viral RNA concentration was determined by real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). To calculate statistically significant differences between groups, the nonparametric Mann–Whitney test was used.Results. In cells treated with small interfering RNAs (siRNAs) targeted at FLT4, Nup98, and Nup205 genes, a significant decrease in their expression and indicators of viral reproduction (virus titer, hemagglutinating activity, viral RNA concentration) was observed at a multiplicity of infection (MOI) = 0.1. Additionally, it was found that a decrease in the expression of target genes using siRNA does not lead to a significant decrease in cell survival. The viral titer in cells treated with siRNA FLT4.2, Nup98.1, and Nup205 on the first day was lower by an average of 1.0 lg, and on the second and third days, by 2.2–2.3 lg, compared to cells treated with nonspecific siRNA. During real-time RT-PCR, a significant decrease in the concentration of viral RNA was observed with siRNA Nup98.1 (up to 190 times) and Nup205 (up to 30 times) on the first day, 26 and 29 times on the second day, and 6 and 30 times on the third day, respectively. For FLT4.2 siRNA, the number of viral RNA copies decreased by 23, 18, and 16 times on the first, second, and third days. Similar results were obtained when determining the hemagglutinating activity of the virus. The hemagglutinating activity on the third day most strongly decreased in cells treated with siRNA Nup205 and FLT4.2 (16 times). In cells treated with siRNA FLT4.1, Nup98.1, and Nup98.2, hemagglutinating activity decreased by 8 times.Conclusions. In the present study, three cellular genes (FLT4, Nup98, and Nup205) were identified—the decrease in the expression of which effectively suppresses viral reproduction— and the original siRNA sequences were obtained. The results obtained are important for creating therapeutic and prophylactic medication, whose action is based on the RNA interference mechanism.Цели. Оценка влияния подавления экспрессии клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205 на динамику репродукции вируса гриппа А в культуре легочных клеток человека А549.Методы. Работа выполнена с использованием оборудования центра коллективного пользования Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им И.И. Мечникова (Россия). Вируссодержащую жидкость отбирали в течение трех дней с момента трансфекции и заражения и оценивали интенсивность вирусной репродукции методами титрования по цитопатическому действию и в реакции гемагглютинации. Концентрацию вирусной РНК определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ). Для вычисления статистически значимых различий между группами использовали непараметрический критерий Манна–Уитни.Результаты. В клетках, обработанных малыми интерферирующими РНК (миРНК) к генам FLT4, Nup98 и Nup205, отмечалось достоверное подавление экспрессии целевых генов и показателей вирусной репродукции (титр вируса, гемагглютинирующая активность, концентрация вирусной РНК) при коэффициенте множественности заражения, равном 0.1. Дополнительно было установлено, что подавление экспрессии целевых генов с помощью миРНК не приводит к значительному снижению выживаемости клеток. Вирусный титр в клетках, обработанных миРНК FLT4.2, Nup98.1 и Nup205, на первые сутки был меньше в среднем на 1.0 lg, а на вторые и третьи – на 2.2–2.3 lg, по сравнению с клетками, обработанными неспецифической миРНК. При проведении ОТ-ПЦР-РВ отмечено достоверное уменьшение концентрации вирусной РНК с миРНК Nup98.1 (до 190 раз) и Nup205 (до 30 раз) на первые сутки, в 26 и в 29 раз на вторые и в 6 и 30 раз на третьи сутки, соответственно. Для миРНК FLT4.2 количество копий вирусной РНК уменьшилось в 23, 18 и 16 раз на первые, вторые и третьи сутки. Схожие результаты были получены при определении гемагглютинирующей активности вируса. Наиболее сильно, в 16 раз, гемагглютинирующая активность на третьи сутки снизилась в клетках, обработанных миРНК Nup205 и FLT4.2. В клетках, обработанных миРНК FLT4.1, Nup98.1 и Nup98.2, гемагглютинирующая активность уменьшилась в 8 раз.Выводы. В ходе исследования были выявлены три клеточных гена (FLT4, Nup98 и Nup205), подавление экспрессии которых позволяет эффективно уменьшить вирусную репродукцию, а также получены оригинальные последовательности миРНК. Полученные результаты имеют важное значение для создания терапевтических и профилактических препаратов, чье действие основано на механизме РНК-интерференции

Использование криотехнологий в трансплантации легких и сердечно-легочного комплекса

Bronchial complications, along with development and progression of chronic dysfunction on the background of chronic rejection, are factors that reduce the quality and life of lung and heart-lung recipients. They also increase the frequency of hospitalizations. Application of cryotechnology is based on the contact effect of extremely low temperatures on organs and tissues using a cryoprobe. This article demonstrates the experience of using cryotechnology in the diagnosis and treatment of complications in lung and heart-lung recipients.Бронхиальные осложнения наряду с развитием и прогрессированием хронической дисфункции на фоне хронического отторжения являются факторами, снижающими качество и продолжительность жизни реципиентов легких и сердечно-легочного комплекса, а также увеличивающими частоту госпитализаций. В основе применения криотехнологий лежит контактное воздействие чрезвычайно низких температур на органы и ткани с помощью криозонда. В данной статье демонстрируется опыт применения криотехнологий в диагностике и лечении осложнений у реципиентов легких и сердечно-легочного комплекса