Dengue and Zika virus capsid proteins bind to membranes and self-assemble into liquid droplets with nucleic acids

Dengue virus (DENV) and Zika virus (ZIKV) capsid proteins efficiently recruit and surround the viral RNA at the endoplasmic reticulum (ER) membrane to yield nascent viral particles. However, little is known either about the molecular mechanisms by which multiple copies of capsid proteins assemble into nucleocapsids (NCs) or how the NC is recruited and wrapped by the ER membrane during particle morphogenesis. Here, we measured relevant interactions concerning this viral process using purified DENV and ZIKV capsid proteins, membranes mimicking the ER lipid composition, and nucleic acids in in vitro conditions to understand the biophysical properties of the RNA genome encapsidation process. We found that both ZIKV and DENV capsid proteins bound to liposomes at liquid-disordered phase regions, docked exogenous membranes, and RNA molecules. Liquid–liquid phase separation is prone to occur when positively charged proteins interact with nucleic acids, which is indeed the case for the studied capsids. We characterized these liquid condensates by measuring nucleic acid partition constants and the extent of water dipolar relaxation, observing a cooperative process for the formation of the new phase that involves a distinct water organization. Our data support a new model in which capsid–RNA complexes directly bind the ER membrane, seeding the process of RNA recruitment for viral particle assembly. These results contribute to our understanding of the viral NC formation as a stable liquid–liquid phase transition, which could be relevant for dengue and Zika gemmation, opening new avenues for antiviral intervention.Fil: Ambroggio, Ernesto Esteban. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Costa Navarro, Guadalupe Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Pérez Socas, Luis Benito. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Bagatolli, Luis Alberto. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. Universidad Nacional de Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; ArgentinaFil: Gamarnik, Andrea Vanesa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentin

Interacción de componentes de la proteína GAG del VIH-1 con modelos de membranas biológicas y su regulación mediada por ácidos nucleicos

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2022.El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es el agente causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida, epidemia que afecta a la sociedad por hace casi ya medio siglo. El ciclo de vida del VIH puede ser dividido en dos grandes etapas: una etapa de eventos tempranos, caracterizada por el reconocimiento de la célula a infectar (linfocito T CD4+), desensamblado de la partícula viral, transcripción reversa e integración de su genoma en el del huésped; y una etapa de eventos tardíos, caracterizada por la producción de proteínas estructurales, el ensamblado a nivel de membrana de las partículas virales, con su posterior salida de la célula y maduración, generándose nuevos virus listos para infectar otras células. La proteína GAG presenta un rol fundamental en la segunda etapa de este proceso, pues es encargada de coordinar el ensamblado del virus a nivel de la membrana plasmática. Varios miles de moléculas de GAG interaccionan entre sí, con ARN y con la membrana celular para formar partículas virales inmaduras, posteriormente liberadas al medio extracelular. Este paso de asociación a membranas de GAG está dirigido por el dominio matriz (MA), ubicado en su región amino terminal. Dicho dominio se encuentra miristoilado y posee una región altamente básica responsable de la interacción con los lípidos negativos de la membrana, en especial con el fosfatidilinositol-(4,5)-bifosfato (PIP2). Además, MA se une a moléculas de ARN, ligandos que pueden actuar como competidores para la interacción con los lípidos, en un mecanismo que está propuesto como fundamental para regular la especificidad del proceso hacia la membrana celular. Teniendo en cuenta este marco biológico, en esta tesis se estudió, desde un punto de vista fisicoquímico, la interacción de componentes amino terminales de GAG con sistemas modelo de biomembranas, analizando cómo esto podría estar regulado por la presencia de oligonucleótidos. Para ello se utilizaron diversos métodos experimentales, que van desde estudios en interfases de monocapas proteicas y lipídicas hasta el uso de sistemas de bicapas. Se emplearon, como modelos de trabajo, a la proteína MA obtenida de forma recombinante, así como a un péptido formado por los primeros 21 aminoácidos de dicha proteína (MA21). Se estudiaron las propiedades de estas moléculas en solución y en la interfase agua-aire, así como su capacidad de asociarse a los modelos de membranas antes mencionados. Se analizó la importancia del ácido mirístico de la región amino terminal de la proteína, observándose un aumento en la estabilidad de MA, tanto en solución como en la interfase agua-aire. Además, fue posible concluir que dicho grupo modificador es importante en la asociación a interfases neutras y que promueve efectos repulsivos que contrastan con el carácter atractivo de las interacciones laterales entre los lípidos aniónicos y los residuos básicos de MA. Por otra parte, se observó que la unión a ácidos nucleicos reduce la estabilidad superficial e interfiere en las interacciones de MA con interfases lipídicas, tanto en términos de su cinética de adsorción como de las interacciones laterales. Adicionalmente, se aprovecharon las propiedades fluorescentes del péptido MA21 para evaluar su partición a membrana, donde se empleó por primera vez el análisis de fasores espectrales en este tipo de estudios. Se observó que las interacciones electrostáticas juegan un papel importante en esta partición y que la miristoilación reduce la energía libre del proceso. Se analizaron los efectos de la presencia de PIP2 y se observó que la mencionada acción reguladora del ARN se mantiene aún en condiciones experimentales donde la afinidad por membranas no es muy diferente en presencia o ausencia de este lípido. Es por ello que este efecto de “competencia” entre los oligonucleótidos y los liposomas no es explicable solamente en base a una relación de afinidades entre moléculas, como es considerado hasta el momento. En esta misma línea, este fenómeno regulador se observó en sistemas de vesículas lipídicas, pero no en monocapas, sugiriendo que las características fisicoquímicas del entorno lipídico del PIP2 también serían importantes y que la sola presencia de este lípido, visto como molécula aislada, no sería una condición suficiente para esta especificidad de MA con la membrana celular. El contenido principal del presente texto se organiza en un capítulo introductorio, cinco capítulos de resultados experimentales, un epílogo y un apéndice. Posterior a este prefacio se encuentra un glosario de las abreviaturas utilizadas (destacando la página en donde son empleadas por primera vez), seguido de la tabla de contenidos del texto principal. El capítulo introductorio contextualiza, de forma cronológica, el marco teórico que dio a luz al proyecto de investigación del cual surge esta tesis y culmina con el planteamiento de los objetivos propuestos. Los capítulos del 1 al 5 denotan los resultados alcanzados y se organizan en función del tipo de sistema de estudio, que son: estudios en solución (capitulo 1), estudios en sistemas de monocapas (capítulos 2 y 3) y estudios en sistemas de bicapas (capítulos 4 y 5). Al final de estos, se incluye un epílogo que resume de forma conjunta las conclusiones principales alcanzadas; seguido de un apéndice que contiene los detalles sobre las metodologías experimentales y el procesamiento de datos empleado. Al final del documento se resumen las referencias bibliográficas citadas a lo largo del texto, así como el índice de figuras, tablas y apartados. Un último comentario previo a la lectura de esta historia. Si bien las leyendas de cada figura denotan claramente su contenido, con el objetivo de facilitarle al lector una familiarización con los resultados, se empleó un sistema de colores consistente a lo largo de la mayor parte del texto. Para entender dicho sistema, primero es necesario anticipar que en este trabajo se utilizaron principalmente cuatro especies de interés que serán apropiadamente introducidas en el capítulo 1, que son la proteína MA y el péptido MA21 en sus variantes miristoiladas y no miristoiladas. Cuando se haga referencia a estas moléculas de modo general (o de modo específico a la variante no miristoilada) se emplearán los términos “MA” o “MA21”, mientras que cuando se haga referencia de forma específica a sus variantes miristoiladas se utilizarán los términos “myrMA” o “myrMA21”. De esta forma, en la mayoría de las figuras el color rojo hará referencia a resultados relacionados con MA, el color negro con myrMA, el color azul con MA21 y el color verde con myrMA21. Sin nada más que agregar, la escena queda lista para adentrarse en esta obra.2024-06-30Fil: Pérez Socas, Luis Benito. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina

The influence of myristoylation, liposome surface charge and nucleic acid interaction in the partition properties of HIV-1 Gag-N-terminal peptides to membranes

The group-specific antigen (GAG) polyprotein of HIV-1 is the main coordinator of the virus assembly process at the plasma membrane (PM) and is directed by its N-terminal matrix domain (MA). MA is myristoylated and possess a highly basic region (HBR) responsible for the interaction with the negative lipids of the PM, especially with PIP2. In addition, MA binds RNA molecules proposed as a regulatory step of the assembly process. Here we study the interaction of a synthetic peptide (N-terminal 21 amino acids of MA) and liposomes of different compositions using a variety of biophysical techniques. Particularly, we use the fluorescence properties of the single tryptophan of the peptide to analyze its partition to membranes, where we harness for first time the analytical ability of spectral phasors method to study this interaction. We found that electrostatic interactions play an important role for peptide partition to membranes and myristoylation reduces the free energy of the process. Interestingly, we observe that while the presence of PIP2 does not cause measurable changes on the peptide-membrane interaction, the interaction is favored by cholesterol. Additionally, we found that the partition process goes through a transition state involving peptide disaggregation and changes in the peptide secondary structure. On the other hand, we found that the presence of oligonucleotides competes with the interaction with lipids by increasing peptide solubility. In summary, we think that our results, in context of the current knowledge of the role of HIV-1 MA, contribute to a better molecular understanding of the membrane association process.Fil: Pérez Socas, Luis Benito. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; ArgentinaFil: Ambroggio, Ernesto Esteban. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentin

HIV-1 Gag specificity for PIP2 is regulated by macromolecular electric properties of both protein and membrane local environments

HIV-1 assembly occurs at the plasma membrane, with the Gag polyprotein playing a crucial role. Gag association with the membrane is directed by the matrix domain (MA), which is myristoylated and has a highly basic region that interacts with anionic lipids. Several pieces of evidence suggest that the presence of phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate (PIP2) highly influences this binding. Furthermore, MA also interacts with nucleic acids, which is proposed to be important for the specificity of GAG for PIP2-containing membranes. It is hypothesized that RNA has a chaperone function by interacting with the MA domain, preventing Gag from associating with unspecific lipid interfaces. Here, we study the interaction of MA with monolayer and bilayer membrane systems, focusing on the specificity for PIP2 and on the possible effects of a Gag N-terminal peptide on impairing the binding for either RNA or membrane. We found that RNA decreases the kinetics of the protein association with lipid monolayers but has no effect on the selectivity for PIP2. Interestingly, for bilayer systems, this selectivity increases in presence of both the peptide and RNA, even for highly negatively charged compositions, where MA alone does not discriminate between membranes with or without PIP2. Therefore, we propose that the specificity of MA for PIP2-containing membranes might be related to the electrostatic properties of both membrane and protein local environments, rather than a simple difference in molecular affinities. This scenario provides a new understanding of the regulation mechanism, with a macromolecular view, rather than considering molecular interactions within a ligand-receptor model.Fil: Pérez Socas, Luis Benito. Universidad Nacional de Córdoba; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Ambroggio, Ernesto Esteban. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba; Argentin

Myristoylation and Oligonucleotide Interaction Modulate Peptide and Protein Surface Properties: The Case of the HIV-1 Matrix Domain

Myristoylated proteins typically develop a tight association with membranes. One example is the matrix domain (MA) of the HIV-1 Gag protein. In addition, MA is able to bind the Sel25 RNA sequence, a ligand that can act as a competitor for the interaction with the membrane. These properties make HIV-1 MA an attractive molecule to understand how protein and peptide surface properties can be controlled by myristoylation and oligonucleotide interaction. In this line, we analyzed the stability, thermodynamics, and the topography of Langmuir monolayers composed of the myristoylated or unmyristoylated versions of MA in the presence or the absence of a single-strand DNA (ssDNASel25) analogue of the Sel25 RNA sequence. With a similar approach, we compared the MA surface properties with those obtained from monolayers of myristoylated and unmyristoylated MA-derived peptides (first 21 residues of the MA sequence). Our results show that the protein or peptide films are destabilized by the presence of ssDNASel25, inducing solubilization of the monolayer components into the bulk phase. In addition, the oligonucleotide affects the protein-protein or peptide-peptide lateral interactions, provoking interfacial topography changes of the monolayers, visualized by Brewster angle microscopy. Furthermore, we also show how the myristoyl group has major effects on the lateral stability and the elasticity of the monolayers. Altogether, here we propose a general model considering the effect of myristoylation and the interaction with oligonucleotides on the interfacial properties of MA and derived peptides. In this model, we introduce a new role of the core region of MA (sequence of MA after the 21st residue) that confers higher lateral interfacial stability to the protein.Fil: Pérez Socas, Luis Benito. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Ambroggio, Ernesto Esteban. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentin

The multigene families of actinoporins (part II): Strategies for heterologous production in Escherichia coli

The sea anemone venom contains pore-forming proteins (PFP) named actinoporins, due to their purification from organisms belonging to Actiniaria order and its ability to form pores in sphingomyelin-containing membranes. Actinoporins are generally basic, monomeric and single-domain small proteins (∼20 kDa) that are classified as α-type PFP since the pore formation in membranes occur through α-helical elements. Different actinoporin isoforms have been isolated from most of the anemones species, as was analyzed in the first part of this review. Several actinoporin full-length genes have been identified from genomic-DNA libraries or messenger RNA. Since the actinoporins lack carbohydrates and disulfide bridges, their expression in bacterial systems is suitable. The actinoporins heterologous expression in Escherichia coli simplifies their production, replaces the natural source reducing the ecological damage in anemone populations, and allows the production of site-specific mutants for the study of the structure-function relationship. In this second part of the review, the strategies for heterologous production of actinoporins in Escherichia coli are analyzed, as well as the different approaches used for their purification. The activity of the recombinant proteins with respect to the wild-type is also reviewed.Fil: Valle, A.. Universidad de La Habana; CubaFil: Hervis, Y. P.. Universidad de La Habana; CubaFil: Pérez Socas, Luis Benito. Universidad de La Habana; Cuba. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Canet, L.. Universidad de La Habana; CubaFil: Faheem, M.. Universidade do Brasília; BrasilFil: Barbosa, J. A. R. G.. Universidade do Brasília; BrasilFil: Lanio, M. E.. Universidad de La Habana; CubaFil: Pazos, I. F.. Universidad de La Habana; Cub

Self-homodimerization of an actinoporin by disulfide bridging reveals implications for their structure and pore formation

Abstract The Trp111 to Cys mutant of sticholysin I, an actinoporin from Stichodactyla helianthus sea anemone, forms a homodimer via a disulfide bridge. The purified dimer is 193 times less hemolytic than the monomer. Ultracentrifugation, dynamic light scattering and size-exclusion chromatography demonstrate that monomers and dimers are the only independent oligomeric states encountered. Indeed, circular dichroism and fluorescence spectroscopies showed that Trp/Tyr residues participate in homodimerization and that the dimer is less thermostable than the monomer. A homodimer three-dimensional model was constructed and indicates that Trp147/Tyr137 are at the homodimer interface. Spectroscopy results validated the 3D-model and assigned 85° to the disulfide bridge dihedral angle responsible for dimerization. The homodimer model suggests that alterations in the membrane/carbohydrate-binding sites in one of the monomers, as result of dimerization, could explain the decrease in the homodimer ability to form pores

Contribución al mecanismo de formación de poros de sticholisina I, una proteína formadora de poros de la anémona Stichodactyla helianthus, mediante el empleo de mutantes de Cys en zonas funcionalmente relevantes de la proteína

Sticholisina I (St I) es una citolisina producida por la anémona marina Stichodactyla helianthus, que se caracteriza por formar poros oligoméricos en membranas naturales y artificiales. En este trabajo se describe la obtención por vía recombinante en Escherichia coli (E. coli) de una variante recombinante de St I (St Ir), así como su caracterización conformacional y funcional. Estos trabajos permitieron reducir el impacto ecológico que provoca la obtención de St I a partir de las anémonas como fuente natural y además realizar mutagénesis sitio-específica para su caracterización funcional. La ausencia de Cys en St I facilitó la introducción de este residuo aminoacídico, por mutagénesis dirigida, en zonas funcionalmente importantes de la toxina. En el trabajo se sustituyeron por Cys en St Ir de forma independiente, los aminoácidos Glu2 y Phe15 (localizados en el segmento de los primeros treinta aminoácidos que participan en la formación del canal) y la Arg52, Pro80 y Trp111 (en la región de interacción con las membranas). Así, se obtuvieron y purificaron de E. coli cinco proteínas mutadas: StI E2C, StI F15C, StI R52C, StI P80C y StI W111C. Los estudios de caracterización espectroscópicos permitieron establecer que las sustituciones aminoacídicas no provocaron cambios conformacionales en los mutantes con respecto a St Ir. Los monómeros de StI E2C, StI R52C y StI P80C mostraron capacidades similares de unión a las membranas en comparación con la variante recombinante. StI F15C mostró un ligero incremento en su capacidad de interacción con las membranas mientras que StI W111C resultó la de menor capacidad de unión. La capacidad formadora de poros de los monómeros, medida en vesículas liposomales y membrana eritrocitaria, resultó similar entre StI E2C, StI F15C y St Ir. Sin embargo, la actividad lítica de StI R52C, StI P80C y StI W111C disminuyó con respecto a St Ir. Los agregados diméricos por enlace disulfuro en StI R52C y StI W111C disminuyeron la actividad biológica de las proteínas. Una de las novedades científicas más importante del presente trabajo radica en que se demuestra que la presencia de agregados diméricos estabilizados por enlace disulfuro, en StI E2C, incrementa la actividad biológica formadora de poros tanto en vesículas liposomales como en eritrocitos. Estos resultados demuestran, por primera vez, que la unión covalente de los extremos aminos de St I potencia la formación de poros funcionales por un mecanismo hasta ahora desconocido. En la investigación se aportan nuevos elementos sobre la importancia de los residuos Glu2, Phe15, Arg52, Pro80 y Trp111 en las etapas de unión inicial a las membranas y de formación de poros durante el mecanismo lítico. Por último, la obtención de los mutantes de Cys abre las posibilidades para el marcaje de St I con sondas de espín o sondas fluorescentes para estudiar el mecanismo de formación de poros mediante las espectroscopias de resonancia paramagnética electrónica (EPR) y de fluorescencia, y sustentan otras aplicaciones nanobiotecnológicas actualmente en desarrollo en nuestro grupo de trabajo.Sticholisin I (St I) is a cytolysin produced by the sea anemone Stichodactyla helianthus, which is characterized by forming oligomeric pores in natural and artificial membranes. This work describes the recombinant production in Escherichia coli (E. coli) of a recombinant variant of St I (St Ir), as well as its conformational and functional characterization. These works allowed us to reduce the ecological impact caused by obtaining St I from anemones as a natural source and also perform site-specific mutagenesis for its functional characterization. The absence of Cys in St I facilitated the introduction of this amino acid residue, by directed mutagenesis, into functionally important areas of the toxin. In the work, the amino acids Glu2 and Phe15 (located in the segment of the first thirty amino acids that participate in the formation of the channel) and Arg52, Pro80 and Trp111 (in the interaction region) were independently replaced by Cys in St Ir. with the membranes). Thus, five mutated proteins were obtained and purified from E. coli: StI E2C, StI F15C, StI R52C, StI P80C and StI W111C. Spectroscopic characterization studies allowed us to establish that amino acid substitutions did not cause conformational changes in the mutants with respect to St Ir. The monomers of StI E2C, StI R52C and StI P80C showed similar binding capacities to membranes compared to the recombinant variant. StI F15C showed a slight increase in its interaction capacity with membranes while StI W111C had the lowest binding capacity. The pore-forming capacity of the monomers, measured in liposomal vesicles and erythrocyte membrane, was similar between StI E2C, StI F15C and St Ir. However, the lytic activity of StI R52C, StI P80C and StI W111C decreased with respect to St Ir The dimeric aggregates by disulfide bond in StI R52C and StI W111C decreased the biological activity of the proteins. One of the most important scientific novelties of the present work is that it is demonstrated that the presence of dimeric aggregates stabilized by disulfide bond, in StI E2C, increases the pore-forming biological activity in both liposomal vesicles and erythrocytes. These results demonstrate, for the first time, that covalent attachment of the amino termini of St I enhances the formation of functional pores by a previously unknown mechanism. The research provides new elements on the importance of residues Glu2, Phe15, Arg52, Pro80 and Trp111 in the stages of initial binding to membranes and pore formation during the lytic mechanism. Finally, obtaining the Cys mutants opens the possibilities for labeling St I with spin probes or fluorescent probes to study the mechanism of pore formation through electron paramagnetic resonance (EPR) and fluorescence spectroscopies, and support other nanobiotechnological applications currently under development in our working group.Universidad Nacional, Costa RicaAcademia de Ciencias de Cuba, CubaEscuela de Ciencias Biológica