N-Glycan structures and N-glycosylation sites of mouse soluble intercellular adhesion molecule-1 revealed by MALDI-TOF and FTICR mass spectrometry

Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a heavily N‐glycosylated transmembrane protein comprising five extracellular Ig-like domains. The soluble isoform of ICAM-1 (sICAM-1), consisting of its extracellular part, is elevated in the cerebrospinal fluid of patients with severe brain trauma. In mouse astrocytes, recombinant mouse sICAM-1 induces the production of the CXC chemokine macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2). MIP-2 induction is glycosylation dependent, as it is strongly enhanced when sICAM-1 carries sialylated, complex-type N-glycans as synthesized by wild-type Chinese hamster ovary (CHO) cells. The present study was aimed at elucidating the N-glycosylation of mouse sICAM-1 expressed in wild-type CHO cells with regard to sialylation, N-glycan profile, and N-glycosylation sites. Ion-exchange chromatography and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) of the released N-glycans showed that sICAM-1 mostly carried di- and trisialylated complex-type N-glycans with or without one fucose. In some sialylated N-glycans, one N-acetylneuraminic acid was replaced by N-glycolylneuraminic acid, and ∼4% carried a higher number of sialic acid residues than of antennae. The N-glycosylation sites of mouse sICAM-1 were analyzed by MALDI-Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR)-MS and nanoLC-ESI-FTICR-MS of tryptic digests of mouse sICAM-1 expressed in the Lec1 mutant of CHO cells. All nine consensus sequences for N-glycosylation were found to be glycosylated. These results show that the N-glycans that enhance the MIP-2‐inducing activity of mouse sICAM-1 are mostly di- and trisialylated complex-type N-glycans including a small fraction carrying more sialic acid residues than antennae and that the nine N-glycosylation sites of mouse sICAM-1 are all glycosylate

The role of brain endothelial MAP kinases in ICAM-1-mediated lymphocyte transmigration

Leukocyte migration from the blood vessel, across the vascular wall and into the tissue underneath occurs in both an inflammatory response as well as immunosurveillance. During this process multiple adhesive interactions occur between leukocytes and vascular endothelial cells (ECs). The EC itself is rendered compliant to transmigration following inside-out signalling in response to leukocyte adhesion altering the activity of a number of different cellular components including the actin cytoskeleton, Rho GTPases and various protein kinases. For this, adhesion to endothelial intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1/CD54) is particularly important and the focus of this study. Indeed, previous work in our lab has shown that endothelial ICAM-1 signalling controls lymphocyte diapedesis by modulating interendothelial VE-cadherin (VEC) junction phosphorylation via a pathway involving calcium, AMP kinase and nitric oxide synthase (eNOS). In this study, I have investigated if ICAM-1-mediated endothelial mitogen-activated protein (MAP) kinases activation played a role during lymphocyte transmigration across brain microvascular ECs. All three MAP kinases, namely ERK, JNK and p38, were found to be activated in response to ICAM-1 engagement, however only JNK was important for lymphocyte transmigration. Significantly, specific neutralisation experiments using small-molecule inhibitors or dominant-negative plasmids inhibiting JNK resulted in inhibition of transmigration. Activation of JNK required Src, Rho GTPase, MKK7 and protein kinase C (PKC), with all these components also found to be important for lymphocyte transmigration. I further demonstrate that this novel pathway led to the phosphorylation of the actin-associated protein paxillin and its association with VEC. Ultimately this triggered VEC internalisation, suggesting that adherens junction modulation is an important element during transendothelial leukocyte migration. Furthermore, this also suggests that at least two endothelial signalling pathways (JNK-paxillin and eNOS-VEC) converge and cooperate to regulate ICAM-1-mediated lymphocyte transmigration

Th1/Th2 imbalance in schizophrenia

Die Schizophrenie ist eine komplexe Erkrankung, bei der neben einer genetischen Komponente äußere Einflussfaktoren eine wichtige Rolle spielen. Epidemiologische Studien weisen auf eine mögliche Rolle von Virusinfektionen als Umwelt-Faktor in der Ätiologie der Schizophrenie hin. Eine Verschiebung der spezifischen Immunantwort in Richtung T-helfer-2-Antwort (ein sogenannter Th2-shift) wurde bei verschiedenen Virusinfektionen beobachtet. Einige immunologische Untersuchungen weisen auch zumindest bei einer Subgruppe der Schizophrenie auf einen Th2-shift hin. (1) Ziele: Diese Studie dient (a) der Untersuchung der Th1/Th2-Balance der spezifischen Immunantwort unter Berücksichtigung der Effekte verschiedener endokrinologischer Parameter und (b) der Identifizierung der möglichen Ursachen des gestörten Th1/Th2-Gleichgewichts; die hier untersuchten Einflussgrößen beziehen sich auf unterschiedliche Hormone. (2) Fragestellungen: (a) Lässt sich eine Th2-Verschiebung bei einer Subgruppe der Schizophrenie beobachten, nachdem die Einflüsse diverser endokrinologischer Parameter mitberücksichtigt worden sind? (b) Wenn ja, ist diese Subgruppe durch klinische oder epidemiologische Variablen charakterisierbar? (c) Wenn ja, welcher oder welche der untersuchten immunologischen und endokrinologischen Parameter tragen zur Streuung des Th1/Th2-Verhältnises bei schizophrenen Patienten bei? (3) Hypothese: (a) Zur Frage (2a) ist eine Th2-Verschiebung angenommen; d.h., die Th1/Th2-Quotienten sind deutlich reduziert. Die Quotienten IFN-g/IL-4, IFN-g/IL-10 und IFN-g/IL-13 wurden als Indikatoren der Th1/Th2-Balance betrachtet. (b) Frage (2b) und (2c) sind offene Fragen, weshalb keine Hypothese im Bezug auf diese beiden Fragen gestellt wurde. (4) Methoden: (a) Analyse-Materialien schließen Serum, Voll-Blut und isolierte Lymphozyten ein. „Vollständige Serum-Daten“ bedeutet, dass alle Daten für Serum-Zytokin-Konzentrationen, Serum Th1/Th2-Quotienten, Hormone, SHBG (Sexhormon-bindendes Globulin), Geschlecht und Alter vorhanden waren. Ebenso bedeutet „vollständige Voll-Blut-Daten“, dass alle Daten bezüglich der in vitro Zytokin-Produktion im Voll-Blut nach einer 46-stündigen PHA-Stimulation, Voll-Blut-Th1/Th2 Quotienten, Hormone, SHBG, Geschlecht und Alter erhoben wurden. „Vollständige Lymphozyten-Daten“ bedeutet, dass alle Daten hinsichtlich der in-vitro Zytokin-Freisetzung bei Lymphozyten, Th1/Th2-Quotienten, Hormone, Geschlecht und Alter verfügbar waren. (b) Studien-Teilnehmer: Insgesamt nahmen 114 schizophrene Patienten und 101 gesunde Probanden an die Studie teil. Unter ihnen hatten 76 schizophrene Patienten und 75 Kontrollen vollständige Serum-Daten, 44 Patienten und 76 normale Kontrollen hatten vollständige Voll-Blut-Daten, 72 schizophrene Patienten und 98 gesunde Teilnehmer hatten vollständige Lymphozyten-Daten. (c) Variablen umfassen hauptsächlich immunologische, endokrinologische und verschiedene klinische Parameter. Die immunologischen Variablen bestehen aus Th1-Zytokinen wie IFN-g, IL-12, IL-2, TNF-a und Th2-Zytokinen einschließlich IL-4, IL-10, IL-13 und IL-6. Die endokrinologischen Kenngrößen setzen sich aus den folgenden Parametern zusammen: zwei Stress-Hormone Cortisol und Prolactin, zwei Geschlechts-Hormone Östradiol und Testosteron, sowie das Geschlechts-Hormon-bindende Globulin (SHBG). Die erhobenen klinischen Daten schließen die Folgenden ein: klinische diagnostische Subgruppen, Familienanamnese bezüglich psychiatrischer Erkrankungen, Medikation vor der Aufnahme, Krankheitsepisode, Antipsychotika-frei/Antipsychotika-naiv, Wash-out-Periode, Erstmanifestationsalter der Erkrankung, Krankheitsdauer, CGI-Werte bei der Aufnahme und Entlassung (CGI = Clinical Global Impressions), sowie die verschieden PANSS Subskalen (Negativ-Symptomatik, Positiv-Symptomatik und Globale Symtpomatik; PANSS = Posivtive and Negative Syndrome Scale). (d) Analyse-Methoden enthalten Cytometric Bead Array (CBA), ELISA und ELISPOT. CBA wurde zur Messung von IFN-g, IL-2, TNF-a, IL-4, IL-10 und IL-6 im Zellkulturüberstand des Voll-Blut-Assays und im Serum verwendet, ELISA wurde zur Bestimmung der IL-12- und IL-13-Produktion im PHA-stimulierten Voll-Blut-Assay eingesetzt, während ELISPOT zum Erfassen der in-vitro-Produktion von IFN-g, IL-12, IL-4, IL-13 und IL-10 bei Lymphozyten benutzt wurde. Die Serumkonzentrationen der Hormone Prolactin, Cortisol, Östradiol, Testosteron, sowie SHBG wurden mit entsprechenden Reagenzienkits am Analysenautomaten Elecsys 2010 erhoben. (e) Auswertung: Die schizophrenen Patienten wurden zuerst als eine ganze Gruppe untersucht, danach nach Geschlecht und verschiedenen klinischen Eigenschaften in unterschiedliche Subgruppen eingeteilt; die so gebildeten verschiedenen Subgruppen sind die unabhängigen Variablen. Die wichtigen abhängigen Variablen sind Th1/Th2-Quotienten einschließlich IFN-g/IL-4, IFN-g/IL-10 (Serum, Voll-Blut-Assay, Lymphozyten) und IFN-g/IL-13 (Lymphozyten). Bei auffälligen Unterschied(en) bezüglich Alter, oder Hormonkonzentrationen und SHBG zwischen einer schizophrenen Subgruppe und den entsprechenden Kontrollen wurden diese Parameter als Kovarianten in die Analyse eingeschlossen, um ihre Effekte auf die Th1/Th2-Balance bei den zu vergleichenden Gruppen zu kontrollieren. (f) Statistik: MAN(C)OVA und Multiple Regression. MAN(C)OVA wurde verwendet, um die Fragestellung (2a) und (2b) zu untersuchen, während Multiple Regression zur Beantwortung der Fragestellung (2c) diente. (5) Primäre Ergebnisse: (a) Die Ergebnisse dieser Studie unterstützen unsere Hypothese einer Th2-Verschiebung zumindest bei einer Subgruppe der Schizophrenie. (b) Befunde bezüglich der Th1/Th2-Balance in Schizophrenie (Resultate der MAN(C)OVA): · Die Serum-Daten deuteten auf eine eindeutige Th2-Verschiebung bei schizophrenen Patienten als Gesamtgruppe hin, nachdem die Effekte von Alter und verschiedener Hormone (insbesondere Prolactin) ausgeschlossen worden waren. · Die Th2-Verschiebung im Serum scheint Schizophrenie-spezifisch zu sein, wie die Daten der Patienten mit schizophrenie-ähnlicher Symptomatik zeigen. · Im geschlechts-spezifischen Vergleich zu gesunden Probanden hatten weibliche schizophrene Patienten signifikant reduzierte Quotient sowohl für Serum IFN-g/IL-4 als auch für IFN-g/IL-10, während männliche Patienten ausschließlich einen deutlich verminderten Serum IFN-g/IL-10 Quotient zeigten. · Reduzierte Serum IFN-g/IL-4- und IFN-g/IL-10-Quotienten wurden ebenfalls bei diversen klinischen Subgruppen beobachtet außer bei schizophrenen Patienten mit vorwiegender Positivsymptomatik. · Ein deutlich reduzierter IFN-g/IL-10-Quotient im PHA-stimulierten Voll-Blut wurde (a) bei Nicht-Paranoid oder chronischen schizophrenen Patienten gezeigt, bei Patienten, die (b) eine positive psychiatrische Familienanamnese hatten und (c) vor Einschluss in die Studie länger als 3 Monate Antipsychotika-frei gewesen waren oder (d) bei Aufnahme in die stationär-psychiatrische Behandlung niedrigere Werte auf der PANSS-Negativ-Skala hatten. Bemerkenswerter weise zeigten auch Antipsychotika-naive Patienten mit Schizophrenie tendenziell einen beträchtlich reduzierten IFN-g/IL-10-Quotient im Voll-Blut. · Die schizophrenen Patienten, deren Symptome nach einer 8-wöchigen Behandlung fast unverändert blieben, hatten auffallend niedrigere IFN-g/IL-4- und IFN-g/IL-10-Quotienten im Voll-Blut als die gesunden Probanden. · Die schizophrenen Patienten mit einem frühen Krankheitsausbruch hatten außergewöhnlich reduzierte Serum IFN-g/IL-4- und IFN-g/IL-10-Quotienten, aber einen erhöhten IFN-g/IL-4 und IFN-g/IL-13 in PHA-stimulierten Lymphozyten. Im Gegensatz zeigten diejenigen mit einem späten Ausbruch keine Änderung der beiden Serum Th1/Th2-Quotienten, jedoch auffallend reduzierte IFN-g/IL-4- und IFN-g/IL-13-Quotienten bei in-vitro stimulierten Lymphozyten. (c) Die möglichen Ursachen der Th1/Th2-Dysbalance bei Schizophrenie-Patienten (Ergebnisse von Multiple-Regression): · Für die schizophrenen Patienten als ganze Gruppe waren vorwiegend IFN-g, IL-4 und IL-10 an die Balance zwischen dem Th1- und Th2-System beteiligt. IL-6 und TNF-a könnten zur Balance zwischen IFN-g und IL-4 im PHA-stimulierten Voll-Blut beigetragen haben, während IL-4 und das Alter offensichtliche Einflüsse auf die Balance zwischen IFN-g und IL-10 im Voll-Blut bei Patienten mit Schizophrenie gehabt haben dürften. · Für die schizophrenen Patientinnen wurde keine eindeutige Quelle für das Ausbalancieren zwischen Serum IFN-g und IL-4 gefunden, obwohl die gemessenen Variablen in der Lage waren, die IFN-g/IL-4-Varianz zuverlässig vorherzusagen (d.h. ³67% oder 2/3 der Varianz waren dadurch erklärbar). Das Abgleichen zwischen IFN-g und IL-4 im Voll-Blut nach PHA-Stimulation wurde eher von den komplexen wechselseitigen Korrelationen unter IFN-g, IL-4, TNF-a, IL-6, Prolactin, Östradiol, Testosteron und Alter beeinflusst. Ähnlich komplexe Inter-Korrelationen unter diesen obengenannten Kenngrößen wurden ebenfalls beim Ausgleichen zwischen IFN-g und IL-10 sowohl im Serum als auch im PHA-stimulierten Voll-Blut beobachtet. · Für männliche schizophrene Patienten gab es vermutlich einige andere entscheidende Faktoren, welche in dieser Studie nicht geprüft worden waren, die jedoch an der Balancierung zwischen IFN-g und IL-10 im Voll-Blut beteiligt gewesen waren. Im Gegensatz zu gesunden Probanden könnten Alter, Prolactin und Östradiol zusätzlich am Abgleichen von Serum IFN-g/IL-10 beteiligt gewesen sein. Hingegen war IL-6 am Abgleichen von IFN-g/IL-10 Voll-Blut-Assay bei männlichen schizophrenen Patienten beteiligt. Beachtenswerte Beiträge von Testosteron, SHBG und Östradiol zur Balancierung vom Voll-Blut IFN-g/IL-10 wie im Fall der Kontrollen waren bei männlichen Patienten mit Schizophrenie nicht zu beobachten. (d) Psychopathologie und Th1/Th2-Quotienten: Der durchschnittliche Messwert auf der PANSS-Negativ-Skala korrelierte positiv mit Voll-Blut-Assay IFN-g/IL-4 und IFN-g/IL-10. Außerdem war der Mittelwert auf der PANSS Global Skala ebenfalls positiv mit Voll-Blut IFN-g/IL-4 assoziiert. (6) Schlussfolgerung und Diskussion: (a) Die Ergebnisse dieser Studie zeigen deutliche Th2-Verschiebungen im Serum bei verschiedenen schizophrenen Subgruppen und bieten einen eher unterstützenden Hinweis für die Hypothese der Th2-Verschiebung von Schizophrenie. (b) Th2-Verschiebungen bei schizophrenen Patienten scheinen eine komplexe Folge von Wechselwirkungen von Krankheitsprozess, Hormonen und antipsychotischer Medikation, jedoch wahrscheinlich nicht nur ein Resultat der antipsychotischen Behandlung oder der durch Alterung ausgelösten Veränderungen zu sein