Avaliação da resistência a antibióticos em estirpes de cianobactérias isoladas de ambientes hídricos

Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015Os ambientes hídricos constituem veículos para a emergência e disseminação da resistência a antibióticos. As cianobactérias encontram-se amplamente distribuídas nestes ambientes, estando frequentemente expostas a antibióticos, bactérias resistentes e genes de resistência. Contudo, o seu papel no resistoma hídrico nunca foi investigado. Este trabalho pretendeu avaliar a susceptibilidade de oito estirpes de Microcystis aeruginosa, oito estirpes de Planktothrix agardhii e oito estirpes de Planktothrix mougeotii a diferentes antibióticos (amoxicilina, ceftazidima, ceftriaxona, canamicina, gentamicina, tetraciclina, ácido nalidíxico, norfloxacina e trimetoprim). Para tal, foi utilizado um procedimento baseado no método standard Broth Microdilution para bactérias, no qual as cianobactérias foram expostas a diluições sucessivas de cada antibiótico em meio Z8 (0,0015 mg/L – 1,6 mg/L) e mantidas numa câmara de culturas sob ciclos de 14 horas de luz – com uma intensidade de 16 ± 4 μEm-2 s-1 – e 10 horas de escuro, a uma temperatura de 20 ± 1ºC. O crescimento celular foi seguido durante 14 dias (observação macroscópica, microscópica e leitura da DO450nm) e as concentrações inibitórias mínimas de cada antibiótico (CIMs) foram calculadas para cada estirpe. Nenhuma das estirpes foi susceptível a qualquer das concentrações de ácido nalidíxico e de trimetoprim testadas. Adicionalmente, as estirpes de M. aeruginosa apresentaram uma susceptibilidade reduzida à tetraciclina, as estirpes de P. agardhii apresentaram uma susceptibilidade reduzida à norfloxacina e as estirpes de P. mougeotii não foram susceptíveis à amoxicilina nem à norfloxacina e apresentaram uma susceptibilidade reduzida à tetraciclina. Foi também pesquisada a presença de genes e de integrões associados à resistência a antibióticos nas cianobactérias em estudo por PCR e posterior sequenciação dos produtos obtidos. Foram encontrados genes de resistência à estreptomicina numa estirpe de M. aeruginosa, em três estirpes de P. agardhii e em quatro estirpes de P. mougeotii; genes de resistência às sulfonamidas em quatro estirpes de M. aeruginosa, em três estirpes de P. agardhii e em cinco estirpes de P. mougeotii; integrões de classe 1 em duas estirpes de M. aeruginosa, em três estirpes de P. agardhii e em três estirpes de P. mougeotii. Adicionalmente, o gene qacE foi encontrado numa estirpe de M. aeruginosa e numa estirpe de P. agardhii. Os resultados obtidos sugerem que as cianobactérias apresentam resistência intrínseca a alguns antibióticos e que, de acordo com o seu local de origem, podem apresentar resistência adquirida a outros. Assim, tudo indica que, de facto, as cianobactérias desempenham um papel importante no resistoma hídrico.Water environments are vehicles for the emergence and dissemination of antibiotic resistance. Cyanobacteria are widely distributed in these environments, where they are often exposed to antibiotics, antibiotic resistant bacteria and resistance genes. However, their role on water resistome was never investigated. This work aimed to evaluate the susceptibility of eight Microcystis aeruginosa strains, eight Planktothrix agardhii strains and eight Planktothrix mougeotii strains to diferent antibiotics (amoxicillin, ceftazidime, ceftriaxone, kanamycin, gentamicin, tetracycline, nalidixic acid, norfloxacin and trimethoprim). For this purpose, it was used a procedure based on the standard Broth Microdilution method for bacteria, in which the cyanobacteria were exposed to serial dilutions of each antibiotic in Z8 medium (0,0015 mg/L – 1,6 mg/L) and kept in a culture chamber under cycles of 14 hours light – with an intensity of 16 ± 4 μEm-2 s-1 – and 10 hours dark, at a temperature of 20 ± 1ºC. Cell growth was followed for 14 days (macroscopic and microscopic observation and determination of DO450nm) and the minimum inhibitory concentrations of each antibiotic (MICs) were calculated for each strain. None of the strains were susceptible to any of the tested concentrations of nalidixic acid and trimetoprim. Additionally, M. aeruginosa strains showed a reduced susceptibility to tetracycline, P. agardhii strains showed a reduced susceptibility to norfloxacin and P. mougeotii strains were not susceptible to amoxicillin and norfloxacin and showed a reduced susceptibility to tetracycline. It was also investigated the presence of antibiotic resistance genes and integrons in the studied cyanobacteria by PCR and subsequent sequencing of the PCR products. Streptomycin resistance genes were found in one M. aeruginosa strain, in three P. agardhii strains and in four P. mougeotii strains; sulfonamide resistance genes were found in four M. aeruginosa strains, in three P. agardhii strains and in five P. mougeotii strains; class 1 integrons were found in two M. aeruginosa strains, in three P. agardhii strains and in three P. mougeotii strains. Additionally, the qacE gene was found in one M. aeruginosa strain and in one P. agardhii strain. The results suggest that cyanobacteria exhibit intrinsic resistance to some antibiotics and that, depending on their origin, they can acquire resistance to others. Thus, it seems that, in fact, cyanobacteria play an important role in water resistome