The role of ecdysone in the timely development of the Drosophila melanogaster brain

Tese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017Para formar um organismo com o tamanho correto e as estruturas estereotípicas que são características de cada espécie, os animais têm de regular o seu crescimento. O tamanho final do corpo e dos órgãos que o constituem é determinado pelo número e tamanho das suas células no final do desenvolvimento. Para regular o crescimento dos diferentes órgãos e tecidos, os animais têm de regular a duração e o rácio do crescimento e proliferação celular. Proliferação celular pode ser definida como o aumento do número de células totais num determinado tecido. Em vários tecidos do organismo nem todas as suas células têm esta capacidade, mas apenas um pequeno grupo de células com capacidades multipotentes, denominadas de células estaminais. Células estaminais são células com a capacidade de produzir os vários tipos de células de um tecido e de se auto renovar mantendo um potencial multipotente. Esta capacidade permite fazer com que estas células proliferem durante um grande período de tempo sem perderem as suas características estaminais. O processo de autorrenovação e proliferação de células estaminais é regulado por fatores intrínsecos à célula e também por fatores extrínsecos. Entre os vários fatores extrínsecos associados à regulação da proliferação e diferenciação das células estaminais, as hormonas são um dos fatores menos estudado apesar que a sua influencia na regulação destas células já ser há muito conhecida. Hormonas são pequenas moléculas produzidas e secretadas por órgãos endócrinos. As suas funções são, entre muitas outras, promover a comunicação entre os vários órgãos do organismo e a regulação de vários processos fisiológicos, desde a reprodução e maturação sexual até à regulação do fornecimento de nutrientes, metabolismo ou mesmo a regulação direta do crescimento dos órgãos e progressão do desenvolvimento. Apesar de hormonas terem sido há muito identificadas como reguladores chave do desenvolvimento e crescimento dos organismos, o seu papel na regulação das células estaminais ainda é pouco compreendido. Drosophila melanogaster é um inseto holometábulo, o que significa que o seu desenvolvimento consiste numa fase embrionária, uma fase larvar composta por três estádios, uma fase de pupa e uma fase de adulto. A duração do desenvolvimento deste animal depende de vários fatores externos como a temperatura e a nutrição ou viabilidade de todos os seus orgãos. O crescimento em Drosophila melanogaster acontece exclusivamente durante o desenvolvimento larvar. Isto significa que o tamanho do individuo adulto é determinado pelo tamanho da larva no final do ultimo estádio larvar e início da metamorfose logo, para compreender como se forma um órgão com o tamanho e proporções corretas é essencial perceber como são regulados os mecanismos que controlam o inicio, a duração e o fim do crescimento. Em Drosophila a temperatura, a nutrição ou a existência de ferimentos nos tecidos são fatores que regulam diretamente o crescimento através da modulação da síntese de hormonas. O desenvolvimento de Drosophila melanogaster está sob o controlo de 3 hormonas e de a interação entre elas. Estas hormonas são a neuro-hormona protorácica (PTTH), a hormona Juvenil (JH) e a ecdisona. A ecdisona é uma hormona esteroide, produzida na glândula protorácica e é um dos principais reguladores fisiológicos do tamanho do corpo e dos órgãos. Depois de produzida esta hormona é libertada transformada na sua forma ativa nos vários tecidos alvo do animal. Cada tecido alvo promove então uma resposta específica a esta hormona. A libertação da ecdisona é feita em picos durante o desenvolvimento e, dependendo da sua contração em circulação no animal a sua função é a indução da transição entre os vários estádios larvares. Durante o terceiro e ultimo estádio larvar, a ecdisona tem a função de ativar as cascatas génicas necessárias para promover as mudanças comportamentais e fisiologias que precedem a metamorfose e levam à transição do estádio larvar para uma pupa. Ao contrário dos outros tecidos do animal, o sistema nervoso da Drosophila melanogaster adulta é formado a partir de um grupo pequeno de células estaminais neuronais, os neuroblastos. Estas células têm origem no embrião e proliferam durante todo o desenvolvimento larvar, dividindo-se assimetricamente para dar origem a duas células, uma célula que mantém a identidade de neuroblasto e uma célula que já está comprometida a diferenciar. A proliferação dos neuroblastos é caracterizada pela expressão de uma cascata temporal de fatores de transcrição que dão a estas células a perceção do seu estádio de desenvolvimento e regulam a formação dos diferentes tipos de neurónios. Durante o desenvolvimento na pupa os neuroblastos continuam a dividir assimetricamente por um período limitado de tempo. No entanto, estas células vão diminuindo de tamanho com cada divisão, entre as 16 e as 86 horas depois da formação da pupa os neuroblastos acabam o seu período proliferativo e desaparecem. A altura em que os neuroblastos começam e acabam esta fase proliferativa tem de ser coordenada com o estado do desenvolvimento do animal para que sejam formados os neurónios corretos em cada fase do desenvolvimento, pois diferentes tipos de neurónios têm de ser formados em diferentes alturas. O numero de neurónios formados no final do desenvolvimento depende também do numero de vezes que os neuroblastos dividem. Embora se saiba que as hormonas regulam o tempo de desenvolvimento, e que o desenvolvimento do sistema nervoso central está muito bem sintonizado com o desenvolvimento do animal, o papel hormonal na regulação da proliferação dos neuroblastos continua pouco descrito. A ecdisona foi recentemente descrita como sendo um regulador chave na mudança de comportamento dos neuroblastos durante o desenvolvimento da pupa. Esta hormona em conjunto com o mediator complex, um complexo proteico que liga fatores de transcrição à RNA polimerase II, mudam a expressão de várias enzimas metabólicas durante a altura da transição de larva para pupa. Este evento vai promover uma transição no metabolismo celular dos neuroblastos, de baseado em glicólise para baseado em fosforilação oxidativa, induzindo a redução to tamanho das células após cada divisão e eventualmente o seu desaparecimento. Ecdisona está descrita como tendo a capacidade de induzir respostas diferentes no mesmo tecido, dependendo to estádio de desenvolvimento ou a sua concentração em circulação. importante na regulação da proliferação e diferenciação dos neuroblastos, embora não se tenha o completo entendimento de como o faz. Este facto associado com a identidade temporal que é característica dos neuroblastos sugere que a diminuição de tamanho e desaparecimento podem ser regulados por esta hormona durante uma janela temporal ou de desenvolvimento específica. O primeiro objetivo deste projeto foi o de perceber se os neuroblastos têm um mecanismo intrínseco que, ou numa altura específica ou depois de um numero de divisões especifico, sinaliza estas células para parar de proliferar ou, se a duração da fase proliferativa dos neuroblastos é regulada exclusivamente por fatores extrínsecos. O segundo objetivo foi o de determinar se existe uma janela de desenvolvimento específica durante a qual a sinalização da hormona ecdisona promove os neuroblastos a diminuir de tamanho após cada divisão, promovendo assim o seu eventual desaparecimento e, a nível celular, este projeto teve como objetivo perceber que fatores permitem que os neuroblastos crescem e proliferem depois de cada divisão. Neste projeto eu mostro que a falta de ecdisona durante o desenvolvimento larval leva a que os neuroblastos continuem a proliferar indefinidamente. Eu mostro também que quando a sinalização de ecdisona é bloqueada apenas durante o desenvolvimento da pupa isto não se verifica. Os meus resultados demonstram que a ecdisona atua durante uma janela de desenvolvimento fechada para ativar uma resposta temporalmente específica nos neuroblastos.Development must be tightly regulated in order to form animals with the appropriate size and correctly differentiated structures. Organ growth is achieved by a balance between cell growth, proliferation, differentiation and death. Stem cells are responsible for generating the differentiated cells that will populate the different tissues of the organism. The growth process is coordinated by hormones that are responsible for modulating development and coordinating the organism’s physiological responses to the external environment. However, the role hormones play in regulating stem cells is still poorly understood. The steroid hormone ecdysone, the central regulator of developmental timing in Drosophila is described to play a critical role in regulating cell proliferation and morphogenesis in tissues like the wing disc and the germ line. Recent work has also demonstrated that this hormone is involved in neural development. Neural stem cells, called neuroblasts are formed in the embryo and proliferate throughout larval development to originate all the neurons and glia present in the adult fly. In pupal stages, these cells cease to proliferate and disappear. The role of ecdysone in the regulation of neuroblast proliferation and fate remains unknown. In this study I demonstrate that the lack of ecdysone during larval development leads neuroblasts to change their behaviour. My results suggest that ecdysone plays a role in regulating the termination of neuroblast proliferation within a specific temporal window in larval developmen

30, 40, 50. 30 anos de Integração Europeia; 40 da Constituição Portuguesa; 50 anos dos Pactos Internacionais da ONU: o que fizeram pelos nossos direitos?

Neste texto, apresentamos uma perspectiva breve sobre a interconexão de três grande marcos para os direitos humanos em Portugal: a integração nas Comunidades Europeias, há trinta anos, em 1986; a Constituição Portuguesa, aprovada em abril de 1976; os Pactos Internacionais dos Direitos Civil e Políticos e dos Direitos Económicos, Sociais e Culturais, adotados em 1966.In this article, we present a brief overview of the interconnection of three milestones regarding human rights in Portugal: the integration in the European Community, which took place thirty years ago, in 1986; the Portuguese Constitution, passed in April 1976; the International Convenants on Civil and Political Rights and on Economic, Social and Cultural Rights, adopted in 1966.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Prática de ensino supervisionada em educaçãon pré-escolar: o património na creche e no jardim-de-infância

Elaborado no âmbito da Prática de Ensino Supervisionada do Mestrado em Educação pré-escolar, o presente relatório pretende dar a conhecer os aspetos inerentes à prática desenvolvida no ano letivo de 2014 / 2015 na instituição Jardim Infantil Nossa Senhora da Piedade de Évora. O relatório integra um tema aprofundado: "O património na Creche e no Jardim-deinfância" e compreende uma preparação cientifica e pedagógica, recorrendo a diversos autores, a uma caraterização do contexto onde estive inserida, à planificação e reflexão, a uma análise da prática de ensino supervisionada e a uma investigação referente a essa mesma prática; Report of the Supervised Teaching Practice to achieve the Master’s Degree in preschool education Abstract: The following report was done focused in the supervised teaching practice of the Master degree on Preschool Education and intends to describe aspects that are related with the practical work developed in the academic year of 2014/2015 in the Jardim Infantil Nossa Senhora da Piedade de Évora. The report integrates one main theme: “The heritage in the nursery and kindergarden” and is composed by a scientific and pedagogic preparation, a characterization of the context where I was inserted, a description of the activity planning and thoughts on it and an analysis and investigation of the supervised teaching

A solidão nos idosos

Este trabalho final da Licenciatura em Gerontologia Social intitula-se: A solidão nos idosos. O presente trabalho tem como objetivos fazer uma abordagem sobre a solidão nos idosos, sobre os fatores e vertentes que podem proporcionar esse sentimento. Contudo este trabalho inicia-se com a dinâmica do envelhecimento e velhice, assim como, salienta as diferenças entre estes para uma melhor perceção da temática abordada. Como vamos poder observar ao longo deste trabalho, a solidão é um sentimento que atinge em particular os idosos devido a diversos fatores como o afastamento destes da Sociedade devido à entrada na reforma a problemas de saúde e/ou viuvez. A solidão não é sentida por todos da mesma forma. O estar só para alguns é sinónimo de solidão mas para outros o facto de terem família não afasta esse sentimento já que muitas vezes não vêm as suas vontades respeitadas e por norma os familiares querem comandar a vida do idoso criando neste um sentimento de revolta e solidão ao mesmo tempo. Esta ausência de respeito e de escassez de obrigatoriedade de uma sociedade cada vez mais egocêntrica levou a que esteja presente neste trabalho o Estatuto do Idoso para que seja feito algo em prol desta situação. Devemos tentar mudar este pensamento egoísta começando pelos mais jovens para que saibam respeitar os idosos de forma a lhes ser atribuído o devido valor, pois outrora já contribuíram para esta sociedade que hoje os despreza e ignora

Physical characterization and spray performance of non-sterile liquid preparations

Dissertação de mestrado em Técnicas de Caracterização e Análise QuímicaThe drug product (DP) under development is composed by a non-sterile liquid preparation and a container closure system. This DP is intended to release a drug substance (DS) in an internai mucosa and to promote the permeation of DS finto the bloodstream for systemic delivery. For that, the development of methods for the physical characterization of the formulation and the spray performance evaluation are required. The tests performed were selected according to the Critical Quality Attributes (CQA) identified for the technology/ product and were based on pharmacopoeias chapters, as well as, on pharmaceutical guidances. The appearance of the formulation was visually inspected and the results revealed clear to slightly opaque formulations. The density (specific gravity) and pH measurement are critical attributes to predict the stability of DP. Viscosity was important to estimate the capability to obtain sprayable formulations and to predict the stability of the DP over time. Adhesion test is crucial to distinguish adhesive over non-adhesive formulations. To study the release profile of the DS, the in vitro drug release test was evaluated and the results depict that the DS was partially or totally released within the first two minutes and allowed comparative studies. The spray performance was investigated using controlled settings with the aid of a specialized equipment — Texture Analyser. The spray actuation test defined the actuation (ActF) and maximum (MaxF) intensity forces required to actuate different spray devices. Pump delivery test was performed to define priming details of the spray device. The results recommended to discard the first 5 to 6 actuations before the administration of the first dose of DP to the patient. After the initial priming, if the product is stored for more than 1 month without use, it is recommended to perform 1 repriming actuation before the administration to the patient (up to 6 months). The tail-off occurs when the dose emitted from the spray device starts decreasing. During the pre-stability evaluation, the weight loss of the spray device containing formulation has also been evaluated. The results showed that, besides the presence of volatile excipients, the weight loss was within an acceptable limit referred by the authorities. Overall, the study of the physical features and the investigation of spray performance support the development ofnon-sterile liquid preparations and are essential to ensure the quality of pharmaceutical product and patient safety. The results obtained help the formulation development team to define the specification according to the CQA for the intended use.O produto em desenvolvimento é composto por uma preparação liquida não estéril e pelo recipiente de isolamento. Este produto deve libertar a substância ativa numa mucosa interna e promover a sua permeação para a corrente sanguínea favorecendo a ação sistémica. Para tal, foi necessário desenvolver métodos para a caraterização física da formulação e para a avaliação do desempenho do dispositivo spray. Estes testes foram selecionados de acordo com os "Critical Quality Attributes" (CQA) identificados para o produto/tecnologia e basearam-se nas farmacopeias e "guidances" farmacêuticas. A aparência da formulação foi avaliada visualmente e os resultados revelaram que as formulações ideais são límpidas ou ligeiramente opacas. A densidade e o pH da formulação são atributos críticos que preveem a estabilidade do produto. A medição da viscosidade das formulações permitiu avaliar a capacidade destas serem dispensadas via spray e estimar a estabilidade do produto. O método de adesão desenvolvido possibilitou a distinção entre formulações adesivas e não adesivas. Por fim, o teste de libertação in vitro da substancia ativa permitiu a realização de testes comparativos entre produtos, tendo-se ainda verificado que a libertação da substância ativa ocorre parcial ou totalmente em 2 minutos. O desempenho do spray foi efetuado utilizando configurações bem definidas com o auxilio de um equipamento especializado - Texture Analyser. O teste de actuação do dispositivo spray define as intensidades de forca de actuação (ActF) e máximas (MaxF) necessárias para os diferentes dispositivos spray analisados. O peso libertado por actuação foi avaliado de forma a definir o perfil de pesos libertados para cada dispositivo spray. Os resultados obtidos recomendam descartar as primeiras 5/6 actuações antes da primeira administração. E, nos casos em que o produto é armazenado sem qualquer utilização de 1 a, pelo menos, 6 meses também é recomendado descartar a primeira actuação antes da administração ao doente. A exaustão do dispositivo spray caraterizou-se pela diminuição da dose emitida. Por fim, a monitorização da perda de peso do produto através de estudos de pré-estabilidade mostrou que, apesar da presença de solventes voláteis, a perda de peso encontra-se nos limites aceitáveis pelas autoridades. Em suma, o estudo das caraterísticas físicas e a avaliação do desempenho do dispositivo spray apoiam o desenvolvimento de preparações liquidas não estéreis e são essenciais para assegurar a qualidade do produto e a segurança do doente. Alem disso, os resultados permitem definir a especificação do produto de acordo com os CQA para o use pretendido

Changes in synaptic plasticity and lipid raft composition in a rat model of temporal lobe epilepsy

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common form of epilepsy. In many cases, patients with TLE are resistant to antiepileptic drugs. Therefore, it is imperative to unravel the underlying molecular mechanisms that are the cause and/or consequence of the disease to find new strategies to fight it. Synaptic plasticity is the ability of synapses to strengthen or weaken the communication efficiency in response to transient variations in their activity. Studies in the pilocarpine rat model of TLE indicate that neuronal hyperactivity in epilepsy is associated with abnormal synaptic plasticity, involving molecular changes in α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptors (AMPARs), in voltage-gated potassium channels Kv4.2, and post-synaptic proteins, post-synaptic protein 95 (PSD-95) and gephyrin. Remodelling of lipid raft composition is believed to contribute to altered cognition and synaptic plasticity observed upon ageing and neurodegenerative diseases. However, it is still unknown if such changes contribute to the cognitive decline and altered synaptic plasticity observed in TLE. In this thesis, an initial study was performed to evaluate changes in Kv4.2. channel levels and its phosphorylation in Thr602, Thr607 and Ser438 observed in non-pathological long-term-potentiation (LTP; a type of synaptic plasticity) induced by a moderate θ-burst stimulation and their relation to PSD-95 and synaptosomal nerve-associated protein 25 (SNAP-25) levels was evaluated by western-blot in hippocampal membranes obtained from stimulated and control slices. As expected, PSD-95 and SNAP-25 levels did not change, but the levels of Kv4.2 channel and its phosphorylation at Ser438 and Thr602 increased following LTP induction, while phosphorylation at Thr607 did not change. These results suggest a possible role for Kv4.2 channels in LTP expression even with mild θ-burst stimulation patterns, through phosphorylation at Ser438 and Thr602 residues. The main objective of this work was to unravel molecular mechanisms underlying TLE regarding the role of lipid raft changes in abnormal synaptic plasticity observed in TLE. For that, several approaches were used to characterize the chronic period of the Li2+-pilocarpine model of TLE in the rat. First, histochemistry was performed in hippocampal slices from 12-month-old Wistar rats exhibiting long-term spontaneous recurrent seizures (SRSs) and Sham controls to evaluate anatomical changes in this tissue. In SRS animals, NeuN immunolabelling revealed a decrease in neurons in the pyramidal cell layer of CA1 and CA3 and in the hilus of the dentate gyrus (DG). Changes in the architecture of the granule cell layer of the DG were also detected for NeuN immunolabelling and Nissl-staining. Finally, using Timm-staining it was possible to detect mossy fibre sprouting. These findings show that the DG is the hippocampal region that suffers more damage in this model. Molecular changes related to synaptic plasticity were studied by performing western-blot in hippocampal membranes isolated from SRS and Sham rats to evaluate: GluA1 and GluA2 AMPARs subunit levels, GluA1 phosphorylation in Ser831 and Ser845 and Kv4.2 channel expression; in addition, molecular changes related to profound changes in synaptic architecture were studied by targeting postsynaptic proteins PSD-95 and gephyrin and the presynaptic marker SNAP-25; finally, changes in planar lipid rafts and caveolae scaffolding proteins, flotillin-1 and caveolin-1 respectively, were monitored. The GluA1 and GluA2 subunit and PSD-95 levels decreased while the GluA1/GluA2 ratio, GluA1 phosphorylation in Ser831 and Ser845, along with gephyrin and caveolin-1 levels increased in SRS animals. SNAP-25, Kv4.2 channel and flotillin-1 levels did not change. To initiate the biophysical study of lipid rafts in model membranes obtained from synaptic lipids from the Li2+-pilocarpine rat model of TLE, the biophysical imaging and quantification of lipid rafts in giant unilamellar vesicles obtained from binary and ternary artificial lipid mixtures was performed. Giant unilamellar vesicles preparation by electroformation was optimized with success. Changes found for AMPARs subunit stoichiometry and phosphorylation contribute to an increase in synaptic transmission that surely contributes to enhancement of neuronal excitability, and to progression of the disease. A decrease in PSD-95 and gephyrin suggests that excitatory transmission is down-regulated and inhibitory transmission is up-regulated, contributing to lower neuronal excitability, hinting on an adaptive molecular mechanism that is trying to counteract the hyperexcitability that characterizes epilepsy. The increase found for caveolin-1 suggests a new role for this protein in TLE, that is probably neuroprotection, as it occurs in other diseases.A epilepsia do lobo temporal (do inglês, TLE) é o tipo de epilepsia mais comum. Na maioria dos casos os pacientes com TLE são resistentes ao tratamento com fármacos antiepiléticos. É importante compreender os mecanismos moleculares subjacentes à doença, de modo a encontrar novas estratégias para combatê-la. Estudos no modelo da pilocarpina em rato indicaram que a hiperexcitabilidade na TLE experimental está associada a plasticidade sináptica anómala, através de alterações moleculares que consequentemente afetam a excitabilidade neuronal. A plasticidade sináptica é a capacidade que as sinapses apresentam de reforçar ou atenuar o seu rendimento em resposta a variações transientes na sua actividade que resultam de estímulos fisiológicos. A nível molecular, este mecanismo é caracterizado por alterações bidirecionais no número e actividade de alguns receptores de neurotransmissores e canais. Na potenciação de longo prazo (do inglês, LTP), o tipo de plasticidade sináptica mais estudado e conhecido no hipocampo, algumas destas alterações incluem o aumento dos receptores de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolo propiónico (Rs AMPA) no neurónio pós-sináptico, que aumenta a eficiência da comunicação glutamatérgica, e diminuição da corrente K+ do tipo A (IA), mediada por canais de potássio dependentes de voltagem 4.2 (Kv4.2), que reduz a excitabilidade dendrítica. A modulação dos Rs AMPA pode afetar a excitabilidade neuronal através de alterações na estequiometria das subunidades e da fosforilação das mesmas. Estas alterações estão ambas implicadas na expressão da LTP no hipocampo assim como nas alterações patológicas em modelos de TLE em roedores. O aumento da excitabilidade neuronal está relacionado com a presença de Rs AMPA sem a subunidade GluA2, permeáveis ao ião Ca2+, e com a fosforilação da subunidade GluA1 na Ser831 e na Ser845, através do aumento dos Rs AMPA com maior condutância, na região sináptica. Alterações na expressão e modulação do canal Kv4.2 foram observadas tanto na LTP como na TLE. Sendo o principal mediador da corrente IA, a sua regulação afeta a excitabilidade dendrítica, que dela depende. Uma forma de modular o canal é através da fosforilação nos resíduos Thr602, Thr607 e Ser438. A densidade pós-sináptica (do inglês, PSD) tem um importante papel na regulação de cascatas de sinalização que ajustam a composição molecular das entidades pós-sinápticas necessárias para manter a plasticidade sináptica. Duas proteínas da PSD associadas à TLE são a proteínas pós-sináptica 95 (PSD-95), que é expressa exclusivamente em sinapses glutamatérgicas (excitatórias), e a gefirina que se encontra exclusivamente em sinapses glicinergicas e GABAergicas (inibitórias). No sistema nervoso podem ser encontradas tanto jangadas lipídicas planares como caveolas, associadas às proteínas específicas, flotilinas e caveolinas, respectivamente. Estas jangadas são microdomínios membranares ordenados, ricos em colesterol e esfingolípidos e que estão associados a diferentes funções celulares. Estudos recentes sugerem que estes microdomínios podem estar envolvidos na plasticidade sináptica, fornecendo a estrutura necessária à organização e compartimentalização de diferentes eventos moleculares na neurotransmissão, tendo também um papel na sua regulação dinâmica de forma a aumentar ou diminuir a eficiência da comunicação sináptica. A remodelação da composição das jangadas lipídicas ocorre durante o desenvolvimento e contribui para alterações cognitivas e de plasticidade sináptica observadas durante o envelhecimento e doenças neurodegenerativas. No entanto, ainda não é claro se tais alterações contribuem para o declínio cognitivo e para as alterações na plasticidade sináptica encontradas na TLE. O principal objectivo deste trabalho foi avaliar as alterações nos marcadores da plasticidade sináptica e na composição sináptica de jangadas lipídicas num modelo de TLE induzida por lítio-pilocarpina no rato, de forma a desvendar os mecanismos moleculares subjacentes à doença. Num primeiro passo avaliaram-se por western-blot as alterações nos níveis e na fosforilação do canal Kv4.2 nos resíduos de Thr602, Thr607 e Ser438, relativamente à PSD-95 e à proteína pre-sináptica SNAP-25, em membranas de hipocampo obtidas de fatias nas quais se induziu LTP com um estímulo θ-burst moderado, que mimetiza a actividade neuronal fisiológica na região CA1 do hipocampo durante a aprendizagem e memória. Apesar dos níveis da proteína pós-sináptica, PSD-95 e da pré-sináptica, SNAP-25 não se alterarem em resposta à estimulação com θ-burst moderado, como era esperado, os níveis do canal Kv4.2 e da sua fosforilação nos resíduos de Ser438 e Thr602 aumentaram. Estes resultados sugerem um papel da regulação do canal Kv4.2 na LTP, através da fosforilação nos resíduos de Ser438 e Thr602. Para a caracterização do modelo de Li2+-pilocarpina no período crónico da TLE, foram primeiro realizados ensaios de histoquímica em fatias de hipocampo de ratos Wistar com 12 meses que exibiam convulsões espontâneas recorrentes (SRSs) induzidas pelo método do Li2+-pilocarpina e com controlos Sham. Nos ratos modelos da TLE de Li2+-pilocarpina, usando o marcador NeuN foi possível observar uma diminuição de neurónios na camada de células piramidais da região CA1 e CA3 e do hilus do giro dentado (DG). Foi vista também uma alteração de disposição dos neurónios da camada de células granulares do DG também observadas em resultados da coloração de Nissl. Por fim, com a coloração de Timm foi possível detetar sprouting axonal no DG nos ratos modelo da TLE, concordante com o observado em trabalhos anteriores. Neste estudo confirmamos então que o DG é a região do hipocampo que sofre maior dano neste modelo, o que é concordante com o observado no DG de pacientes com TLE. As alterações moleculares associadas à plasticidade sináptica foram avaliadas por western-blot em membranas de hipocampo obtidas de ratos modelo da TLE e Sham tendo como alvo: a subunidade GluA1 e GluA2 dos Rs AMPA, a fosforilação da subunidade GluA1 nos resíduos de Ser831 e na Ser845 e a expressão do canal Kv4.2. Para avaliar alterações estruturais nas sinapses estudaram-se as proteínas da PSD, PSD-95 e gefirina e o marcador pré-sináptico SNAP-25. Por fim, estudou-se a expressão das proteínas específicas de jangadas lipídicas, flotilina-1 e caveolina-1. Os níveis de subunidade GluA1 e GluA2 diminuíram em ratos modelo da TLE, enquanto que a razão GluA1/GluA2 e a fosforilação da subunidade GluA1 na Ser831 e na Ser845 aumentaram. Estas alterações contribuem para um aumento da transmissão glutamatérgica que certamente contribui para o aumento da excitabilidade neuronal, e para a progressão da doença. Os níveis de SNAP-25 não se alteraram nos ratos modelo da TLE de Li2+-pilocarpina. Face aos níveis desta proteína a expressão relativa de PSD-95 diminuiu enquanto que a da gefirina aumentou. Uma vez que o PSD-95 e a gefirina são específicos para sinapses glutamatérgicas e GABAérgicas/glicinérgicas, respetivamente, estes resultados evidenciam que há mecanismos associados à transmissão glutamatérgica que estão diminuídos neste modelo enquanto que outros associados à transmissão GABAérgica/glicinérgica estão aumentados. Isto, por sua vez, sugere um aumento da transmissão inibitória e diminuição da excitatória, o que na totalidade diminui a excitabilidade neuronal. Esta alteração das proteínas da PSD poderá ser um mecanismo de adaptação molecular para contrariar a hiperexcitabilidade causada em parte pelas alterações descritas para os Rs AMPA, garantindo a sobrevivência do animal. A expressão do canal Kv4.2 não se alterou nos animais modelo da TLE, no entanto observa-se uma tendência para aumento e o estudo de um número mais elevado de animais poderá tornar mais clara esta questão. Finalmente, os níveis de flotilina-1 não se alteraram no modelo de TLE em rato enquanto que os níveis de caveolina-1 aumentaram, sugerindo que a caveolina-1 e alterações nas jangadas lipídicas têm um papel na fisiopatologia da TLE. Face à sua ação noutros modelos de doença no SNC, este papel será provavelmente neuroprotector. Para iniciar o estudo biofísico de jangadas lipídicas em membranas modelo preparadas com lípidos sinápticos do rato modelo da TLE de Li2+-pilocarpina, foram realizadas a deteção e quantificação biofísica de jangadas lipídicas em vesículas gigantes unilamelares preparadas com misturas de lípidos artificiais. A otimização da preparação de vesículas gigantes unilamelares por eletroformação foi efetuada com sucesso. Este trabalho revela alterações moleculares nunca descritas tanto para a LTP como para o período crónico da TLE no modelo de Li2+-pilocarpina em rato. No entanto, serão necessários estudos adicionais para melhor compreender o que é causa ou consequência da doença e, mais importante, o que pode ser feito para tratar ou prevenir a TLE

Ontology-services agent to help in the structural and semantic heterogeneity

In the Virtual Enterprises (VE) environment, interactions between distributed heterogeneous computing entities representing different enterprises, people and resources, take place. These interactions, in order to be both syntactic and semantic compatible, need to follow appropriate standards (ontologies) well understood by all the participants. Even for each domain ontology, people may store their data in different structures and use different terms to represent the same concept. This paper focuses on an effort to create an Ontology-Services Agent to monitor the communication acts taking place in a Multi-agent System. The Ontology-Services Agent provides help in solving the Structural and Semantic Heterogeneity problem, enabling appropriate conversations and making it possible meaningful agreements between agents representing different enterprises and resources in a VE environment

Improving foetal and neonatal echo-planar imaging with image-based shimming

Tese de mestrado integrado em Engenharia Biomédica e Biofísica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015O Developing Human Connectome Project pretende realizar um progresso científico único através da criação do primeiro connectome 4D no início da vida do bebé. De forma a criar um mapa dinâmico da conectividade do cérebro do bebé, é fundamental obter imagens funcionais e com ponderação em difusão. A imagem eco-planar (EPI) é a principal sequência de ressonância magnética aplicada na aquisição dessa informação. Esta sequência permite uma aquisição rápida e repetida de imagens cerebrais permitindo mapear as flutuações da atividade cerebral (imagiologia funcional) bem como ter uma boa resolução nas imagens de difusão (movimento de moléculas de água no volume cerebral). No entanto, esta técnica está associada a artefactos de suscetibilidade. Estes artefactos surgem quando existem interfaces entre duas amostras com suscetibilidades magnéticas diferentes como sejam o tecido biológico e o ar. De forma a minimizar esses artefactos é necessário reduzir as heterogeneidades do campo magnético principal B0 através de shimming. O presente trabalho focou-se em shimming ativo, no qual o campo magnético é mapeado com base num modelo composto por funções harmónicas esféricas e são calculadas as correntes a aplicar às bobinas de shimming. Essas bobinas geram um campo magnético que compensa as heterogeneidades presentes anteriormente. Convencionalmente, as tentativas para superar este problema envolvem a utilização do método disponibilizado no sistema de ressonância magnética, nas quais o campo é mapeado com base em projecções (ex: FASTMAP). Este método é de execução rápida mas apresenta duas desvantagens principais: em primeiro lugar, o utilizador tem um controlo reduzido sobre o processo; em segundo, as regiões nas quais o campo é mapeado não são definidas com base na anatomia de interesse. No contexto deste trabalho, o controlo sobre o processo é importante no sentido de ser possível aplicar exatamente a mesma metodologia a um grupo elevado de sujeitos. Por seu lado, o mapeamento com base na anatomia permite obter uma optimização mais precisa. Com o surgimento de novas tecnologias passou a ser possível fazer um mapeamento mais detalhado do campo magnético com técnicas baseadas em imagem ao invés de projecções. Estas técnicas envolvem a definição de um volume relacionado com a anatomia, e que é incluído na totalidade na optimização do campo. O principal objetivo deste trabalho foi desenvolver uma ferramenta de shimming baseado em imagem a fim de otimizar o campo magnético no contexto de imagens de EPI do cérebro neonatal e fetal. O cérebro do bebé sofre alterações na sua dimensão e forma durante o seu desenvolvimento desde a idade fetal até neonatal. Em cada uma dessas fases o bebé encontra-se cercado por um ambiente diferente que requere uma abordagem específica ao mesmo. Neste sentido, o trabalho desenvolvido foi dividido em três partes principais: descrição da estrutura necessária para a correta aplicação do shimming, shimming neonatal e shimming fetal. Em primeiro lugar, as limitações do shimming baseado em imagem foram estudadas e o algoritmo básico para aplicar o método foi testado. Nesta parte do trabalho foi demonstrado que os campos gerados pelas bobinas de shim presentes no equipamento de ressonância magnética são consistentes com as funções harmónicas esféricas que compõem o modelo aplicado. O efeito do movimento da cama do equipamento sobre a eficiência do shimming foi também estudada. Foi possível corrigir a informação do sistema de coordenadas que descrevem o mapa de campo B0 de forma a incluir o movimento da cama necessário para a obtenção das imagens em sujeitos fetais. A segunda parte do trabalho focou-se no desenvolvimento do shimming para o caso neonatal. Foi desenvolvida uma ferramenta para definição de uma região de interesse, unwrapping da fase e cálculo das correntes de shim. Esta foi desenvolvida em ambiente MATLAB. Nos recém-nascidos o shimming deve ser aplicado numa região de interesse restrita ao cérebro devido à presença da interface ar/tecido no escalpe do bebé. Assim, a definição da região de interesse consistiu principalmente na aplicação de um limiar a fim de binarizar a imagem de magnitude, ajustada pelo utilizador. Em simultâneo foi implementada uma técnica de exclusão dos olhos com base na anatomia dos diferentes planos. No seu conjunto o método apresentou-se flexível de forma a ser ajustado ao sujeito em estudo. Quando aplicado com a mesma metodologia (limiar e exclusão de olhos) o volume incluído foi semelhante entre bebés. O método de shimming foi avaliado com base em três medidas de dispersão do mapa de campo residual: largura a meia altura, desvio padrão dos pixéis no interior da região de interesse e o intervalo de frequências no interior do qual 95 % dos pixéis se encontravam. A utilização de diferentes medidas permitiu a avaliação do m´etodo em relação a diferentes aspetos. Este método foi aplicado a 52 participantes recém-nascidos com idade gestacional média de 39.8 ± 1.7 semanas. O cálculo das correntes de shim permitiu gerar um campo magnético que melhorou a homogeneidade do campo B0 no volume adquirido, sendo consistente com o previsto. Uma imagem média do campo residual foi calculada mostrando que existem duas regiões (occipital e pequenas regiões laterais) nas quais o campo magnético B0 apresenta ainda heterogeneidades. Por fim, os resultados indicam que este método melhorou o campo perto da periferia do cérebro quando comparado com o método convencional disponibilizado no equipamento. O shimming neonatal (shimming ótimo ou OIBS) foi utilizado como alicerce para a implementação de um método ajustado às características das aquisições fetais. Existem duas características principais que devem ser tidas em conta. Em primeiro lugar, os fetos encontram-se envoltos em líquido amniótico e tecido materno pelo que o ambiente no qual estão inseridos permite que a região de interesse seja definida de forma menos restrita. Em segundo lugar, o facto de a cabeça do feto ser pequena pode levar à existência de valores de corrente das bobinas de shim elevados. Essas correntes, principalmente associadas às bobinas de segunda ordem geram campos de magnitude elevada na região do tecido adiposo, o que altera a sua frequência de ressonância. Desta forma, as técnicas de supressão de gordura específicas em frequência são menos efetivas e a imagem de EPI apresenta artefactos. Assim, a ferramenta para shimming fetal incluiu a definição de uma região de interesse cilíndrica e um método de shimming baseado em imagem com limites lineares (shimming limitado ou CIBS) impostos com base na frequência de ressonância do tecido adiposo. O CIBS consistiu na aplicação de limites superiores e inferiores ([-300 100] Hz) para a frequência dos pixéis pertencentes à gordura após a aplicação do shimming. Adicionalmente, o impulso de radiofrequência utilizado para a supressão de gordura foi estudado a fim o otimizar para a sua utilização no contexto do shimming fetal. Para o estudo dos parâmetros do impulso de radiofrequência, os rins de dois voluntários adultos saudáveis foram utilizados como simulação do ambiente fetal, devido as semelhanças entre a localização e interface entre tecidos. Os métodos OIBS e CIBS foram aplicados em 6 grávidas saudáveis com idades gestacional média de 28±6 semanas. Os mapas de campo residuais mostraram que as técnicas eram semelhantes em termos de homogeneidade no interior da região de interesse definida como cérebro, mas a segunda (CIBS) apresentou melhores resultados na supressão de gordura. Como estudo do impulso de radiofrequência foi demonstrado que o desvio do impulso em cerca de 100 Hz no sentido da frequência de ressonância da água melhoraria a supressão de gordura sem detrimento do sinal da água. A utilização do novo método CIBS em simultâneo com um impulso de radiofrequência otimizado mostrou ser a melhor solução para homogeneizar o campo e suprimir a gordura. Em conclusão, as ferramentas apresentadas permitiram melhorar a qualidade das imagens de EPI da cabeça do feto e do recém-nascido no contexto do Developing Human Connectome Project. O shimming neonatal mostrou ser um método consistente que pode facilmente ser utilizado por parte da equipa clínica. A nível fetal foi apresentado um método que demonstra a capacidade de superar as limitações demonstradas pelas técnicas convencionais.The Developing Human Connectome Project (dHCP) aims to make major scientific progress by creating the first 4-dimensional connectome of early life. Echo planar imaging (EPI) is the main acquisition technique applied in functional and diffusion imaging, which are central to map the human brain. This technique allows fast acquisition of spatial information enabling volumetric coverage of the whole brain, but it is associated with susceptibility artefacts. In order to minimize those artefacts it is necessary to reduce main magnetic field B0 in homogeneities through shimming. Conventionally, the attempts to overcome this problem use the manufacturer’s default method. Unfortunately, with those techniques the user has little control over the process, and the regions within which the field is corrected are not anatomically based. The main objective of this project was to develop an image-based shimming tool to optimize the magnetic field in the context of EPI images adjusted to the neonatal and foetal brains. The babies’ brain suffers changes in dimension and shape during its development from foetal to neonatal age. In each one of those stages the baby is surrounded by a different environment which requires a distinct shimming approach. As a result, the work was divided into three main parts: framework description, neonatal shimming and foetal shimming. First, the limitations of image-based shimming were investigated, and the framework to apply the method was described. It was demonstrated that fields generated by shim coils were consistent with the spherical harmonic model applied. In addition, the coordinate information of the B0 field map was corrected in order to include the table displacement needed for foetal imaging. Second, a tool was developed for neonatal shimming. The tool included region-of-interest (ROI) definition, phase unwrapping and shim calculation. The ROI definition implemented was flexible in order to adjust to each subject under study. When applying this approach while keeping the same threshold/eye exclusion methodology the volume included was similar between babies. The shim calculation allowed to generate shim values that improved homogeneity of the magnetic field within the volume imaged. This method slightly improved the field near the brain’s margins when compared with the manufacturer’s default techniques. Finally, for foetal shimming the groundwork of the neonatal tool was adjusted to this cohort characteristics. The tool for foetal shimming included additional cylindrical ROI definition and constrained image-based shimming. The constrained shimming allowed to account for the mother’s adipose tissue which in the presence of high shim values can lead to imperfect fat suppression. Along with the implementation of shimming tools, the radio frequency pulse used for fat suppression was studied. The new constrained image-based shimming showed similar results in terms of field homogeneity within the fetus’ brain when compared with the optimal image based shimming, with improvement of fat suppression that is enhanced when simultaneously used with the optimized fat suppression radiofrequency pulse

Análise Biomecânica de Calo Ósseo usando Método Sem Malha

O osso é um tecido fisiologicamente dinâmico e que quando lesionado tem a capacidade de se reparar com o próprio tecido, não envolvendo um tecido cicatrizante, ao contrário de outros tecidos. Esta característica torna-o particularmente interessante para investigar os processos inerentes de fraturas ósseas. A maior parte das fraturas cicatriza através de uma sequência de processos de diferenciação de tecidos, desde os processos iniciais de hematoma, aos tecidos conjuntivos, e através da cartilagem ao osso. No entanto, qualquer falha neste processo pode resultar em uniões tardias, más uniões ou não uniões. A compreensão na totalidade deste processo ainda constitui um desafio. Os mecanismos que envolvem os processos de estimulação mecânica não se encontram bem compreendidos, em consequência da complexidade dos testes experimentais in vivo, que se tornam dependentes de dados in vitro, tornando difícil validar os pressupostos biológicos. Consequentemente, os modelos computacionais têm demonstrado serem bastante úteis e eficazes na investigação sobre a cicatrização óssea. Desta forma, com o presente trabalho foi possível analisar as condições mecânicas de um calo ósseo resultante de uma fratura, assim como compreender as metodologias de análise numérica aplicadas. O modelo teve por base um estudo in vivo de forma a obter uma variação temporal progressiva da forma do calo e das propriedades mecânicas durante a cicatrização óssea. Com este modelo obtiveram-se os campos de tensão e deformação nas diferentes fases do processo de regeneração, obtendo-se resultados que se encontram em conformidade com a literatura. Adicionalmente, foi aplicado um algoritmo de remodelação óssea em combinação com o Radial Point Interpolation Method (RPIM) que foi capaz de reproduzir as condições apresentadas pela respetiva imagem histológica nesta fase. Por último, espera-se que os trabalhos desenvolvidos neste âmbito possibilitem a conceção de estratégias mais precisas e eficazes tanto para o tratamento como para aceleração da cura. De forma complementar, encontram-se em desenvolvimento modelos específicos dos pacientes e que incorporam variabilidade genética.Bone is a physiologically dynamic tissue that, when injured, has the ability to repair itself, not involving scar tissue, unlike other tissues. This characteristic makes it particularly interesting for investigating the inherent processes of bone fractures. Most fractures heal through a sequence of tissue differentiation processes, from the initial hematoma, to connective tissues and through cartilage to bone. However, any failure in this process can result in a delayed union, mal-union or non-union. A complete understanding of this process is still a challenge. The mechanisms surrounding the mechanical stimulation processes are relatively poorly understood as a result of the complexity of in vivo experimental tests, which become dependent on in vitro data, making it difficult to validate the biological assumptions. Consequently, computational models have proven to be very useful and effective in the investigation of bone healing. Therefore, in the present work, it was possible to analyse the mechanical conditions of a bone callus as a consequence of a fracture and to understand the methodologies of numerical analysis applied. The model was based on an in vivo experimental study in order to obtain a progressive temporal variation of the callus shape and mechanical properties during bone healing. With this model, the stress and strain fields in the different phases of the regeneration process were obtained, where the results are in agreement with the literature. Additionally, a bone remodelling algorithm was applied in combination with the Radial Point Interpolation Method (RPIM), which was able to reproduce the conditions presented by the respective histological image at this stage. Finally, it is expected that the work developed in this area will enable the design of more accurate and effective strategies for both treatment and accelerating healing. Complementarily, patient-specific models and the incorporation of genetic variability are being developed