Donor selection in a pediatric stem cell transplantation cohort using PIRCHE and HLA‐DPB1 typing

Background: New strategies to optimize donor selection for hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) have mainly been evaluated in adults, but the disease spectrum requiring HSCT differs significantly in children and has consequences for the risk of complications, such as graft-versus-host disease (GvHD). Procedures: Here we evaluated whether HLA-DPB1 and Predicted Indirectly ReCognizable HLA-Epitope (PIRCHE) matching can improve donor selection and minimize risks specific for a pediatric cohort undergoing HSCT in Berlin between 2014 and 2016. Results: The percentage of HLA-DPB1–mismatched HSCT in the pediatric cohort was in line with the general distribution among matched unrelated donor HSCT. Nonpermissive HLA-DPB1 mismatches were not associated with a higher incidence of GvHD, but the incidence of relapse was higher in patients undergoing HSCT from HLA-DPB1–matched transplantations. High PIRCHE-I scores were associated with a significantly higher risk for developing GvHD in patients undergoing HSCT from nine of ten matched unrelated donors. This finding persisted after including HLA-DPB1 into the PIRCHE analysis. Conclusions: Implementing PIRCHE typing in the donor selection process for HSCT in children could particularly benefit children with nonmalignant diseases and support further validation of PIRCHE-based donor selection in a larger number of children treated at different sites

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation from sibling and unrelated donors in pediatric patients with sickle cell disease—A single center experience

HSCT is curative in SCD. Patients with HLA-identical sibling donor have an excellent outcome ranging from 90%-100% overall and event-free survival. However, due to the lack of matched sibling donors this option is out of reach for 70% of patients with SCD. The pool of potential donors needs to be extended. Transplantations from HLA-matched unrelated donors were reported to be less successful with shorter event-free survival and higher incidences of complications including graft-vs-host disease, especially in patients with advanced stage SCD. Here we report transplantation outcomes for 25 children with SCD transplanted using HLA-matched grafts from related or unrelated donors. Overall survival was 100% with no severe (grade III-IV) graft-vs-host disease and a 12% rejection rate. Mixed donor chimerisms only occurred in transplantations from siblings, while transplantations from unrelated donors resulted in either complete donor chimerism or rejection. Despite the small patient number, overall and disease-free survival for unrelated donor transplantations is excellent in this cohort. The advanced disease state, higher alloreactive effect and stronger immunosuppression in unrelated donor transplantations raises patient risk, for which possible solutions could be found in optimization of transplant preparation, graft manipulation or haploidentical transplantation using T cell receptor α/β-depleted grafts

Tumor-Derived Extracellular Vesicles Impair CD171-Specific CD4+ CAR T Cell Efficacy

Chimeric antigen receptor (CAR) T cell efficacy against solid tumors is currently limited by several immune escape mechanisms, which may include tumor-derived extracellular vesicles. Advanced neuroblastoma is an aggressive childhood tumor without curative treatment options for most relapsed patients today. We here evaluated the role of tumor-derived extracellular vesicles on the efficacy of CAR T cells targeting the neuroblastoma-specific antigen, CD171. For this purpose, CAR T cell activation, cytokine production, exhaustion, and tumor cell-directed cytotoxicity upon co-culture was evaluated. Tumor-derived extracellular vesicles isolated from SH-SY5Y neuroblastoma cells neither affected CAR T cell activation nor expression of inhibitory markers. Importantly, exposure of CD4+ CD171-specific CAR T cells to tumor-derived extracellular vesicles significantly impaired tumor cytotoxicity of CAR T cells. This effect was independent of neurotrophic receptor tyrosine kinases 1 or 2 (NTRK1, NTRK2) expression, which is known to impact immune responses against neuroblastoma. Our results demonstrate for the first time the impact of tumor-derived extracellular vesicles and non-cell-mediated tumor-suppressive effects on CD4+ CAR T cell efficacy in a preclinical setting. We conclude that these factors should be considered for any CAR T cell-based therapy to make CAR T cell therapy successful against solid tumors

Genetic modifiers of fetal hemoglobin affect the course of sickle cell disease in patients treated with hydroxyurea

The course of sickle cell disease (SCD) is modified by polymorphisms boosting fetal hemoglobin (HbF) synthesis. However, it has remained an open question how these polymorphisms affect patients who are treated with the HbF-inducing drug hydroxyurea/ hydroxycarbamide. The German SCD registry offers the opportunity to answer this question, because >90% of patients are treated according to national guidelines recommending the use of hydroxyurea in all patients above 2 years of age. We analyzed the modifying effect of HbF-related genetic polymorphisms in 417 patients with homozygous SCD >2 years old who received hydroxyurea. HbF levels were correlated with higher total hemoglobin levels, lower rates of hemolysis, a lower frequency of painful crises and of red blood cell transfusions. The minor alleles of the polymorphisms in the γ-globin promoter (rs7482144), BCL11A (rs1427407) and HMIP (rs66650371) were strongly associated with increased HbF levels. However, these associations did not translate into lower frequencies of vaso-occlusive events which did not differ between patients either carrying or not carrying the HMIP and BCL11A polymorphisms. Patients on hydroxyurea carrying the γ-globin promoter polymorphism demonstrated substantially higher hemoglobin levels (P<10-4) but also higher frequencies of painful crises and hospitalizations (P<0.01) when compared to patients without this polymorphism. Taken together, these data indicate that the γ-globin, HMIP and BCL11A polymorphisms correlate with increased HbF in SCD patients on hydroxyurea. While HbF is negatively correlated with the frequency of painful crises and hospitalizations, this was not observed for the presence of known HbF-boosting alleles

Ruxolitinib for Glucocorticoid-Refractory Acute Graft-versus-Host Disease

BACKGROUND: Acute graft-versus-host disease (GVHD) remains a major limitation of allogeneic stem-cell transplantation; not all patients have a response to standard glucocorticoid treatment. In a phase 2 trial, ruxolitinib, a selective Janus kinase (JAK1 and JAK2) inhibitor, showed potential efficacy in patients with glucocorticoid-refractory acute GVHD. METHODS: We conducted a multicenter, randomized, open-label, phase 3 trial comparing the efficacy and safety of oral ruxolitinib (10 mg twice daily) with the investigator's choice of therapy from a list of nine commonly used options (control) in patients 12 years of age or older who had glucocorticoid-refractory acute GVHD after allogeneic stem-cell transplantation. The primary end point was overall response (complete response or partial response) at day 28. The key secondary end point was durable overall response at day 56. RESULTS: A total of 309 patients underwent randomization; 154 patients were assigned to the ruxolitinib group and 155 to the control group. Overall response at day 28 was higher in the ruxolitinib group than in the control group (62% [96 patients] vs. 39% [61]; odds ratio, 2.64; 95% confidence interval [CI], 1.65 to 4.22; P<0.001). Durable overall response at day 56 was higher in the ruxolitinib group than in the control group (40% [61 patients] vs. 22% [34]; odds ratio, 2.38; 95% CI, 1.43 to 3.94; P<0.001). The estimated cumulative incidence of loss of response at 6 months was 10% in the ruxolitinib group and 39% in the control group. The median failure-free survival was considerably longer with ruxolitinib than with control (5.0 months vs. 1.0 month; hazard ratio for relapse or progression of hematologic disease, non-relapse-related death, or addition of new systemic therapy for acute GVHD, 0.46; 95% CI, 0.35 to 0.60). The median overall survival was 11.1 months in the ruxolitinib group and 6.5 months in the control group (hazard ratio for death, 0.83; 95% CI, 0.60 to 1.15). The most common adverse events up to day 28 were thrombocytopenia (in 50 of 152 patients [33%] in the ruxolitinib group and 27 of 150 [18%] in the control group), anemia (in 46 [30%] and 42 [28%], respectively), and cytomegalovirus infection (in 39 [26%] and 31 [21%]). CONCLUSIONS: Ruxolitinib therapy led to significant improvements in efficacy outcomes, with a higher incidence of thrombocytopenia, the most frequent toxic effect, than that observed with control therapy

Donor choice for allogeneic stem cell transplantation in children and adolescents

In meiner Arbeit habe ich fünf Publikationen vorgestellt, die sich mit der Spender*innen-Auswahl und der Transplantationsvorbereitung für die allogene Stammzelltransplantation im Kindesalter beschäftigen. In der pädiatrischen Stammzelltransplantation liegt die Besonderheit in der Vielfältigkeit der Grunderkrankungen, die einer allogenen Stammzelltransplantation bedürfen. Jede Erkrankung bedarf eines anderen wohlabgestimmten Therapieansatzes, der sowohl Komorbiditäten als auch Outcome-Prioritäten mit einbezieht. Ein grundlegender Unterschied besteht zwischen malignen und non-malignen Erkrankungen. Für die Transplantation der ALL im Kindesalter konnten wir mit der Bestimmung des KIR-Profils von Spender*innen und Empfänger*innen in einer Kohorte nach haploidenter Stammzelltransplantation eine signifikant reduzierte Rückfallrate nach Transplantation von einem*r Spender*in mit aktivierendem KIR-Profil nachweisen. Der entwickelte KIR B content score wurde in den Auswahlalgorithmus mit aufgenommen. In einer weiteren ALL Kohorte konnten wir auch für die Transplantation von einer*m Geschwister- oder Fremdspender*in einen Überlebensvorteil in Assoziation mit dem c/t KIR score nachweisen. Die KIR-Aktivität kann letztlich als NK-Zell vermittelte GvL-Aktivität verstanden werden. HLA-DPB1 und PIRCHE sind weitere Algorithmen, die die HLA und HLA-Epitop bedingte Alloreaktivität einer Stammzelltransplantation abschätzen sollen. In der von uns untersuchten Kohorte konnte zum einen das GvHD Risiko mit dem PIRCHE Score korreliert werden, zum anderen eine tendenziell höhere Rückfallrate für HLA-DPB1 gematchte Transplantationen ausgemacht werden. Das Problem der immunologischen Gleichheit/verminderten Alloreaktivität findet sich auch in der Transplantation der non-malignen Erkrankungen, insbesondere der Sichelzellkrankheit, wieder. Im Vergleich der MSD und MUD-Transplantation sind die Geschwistertransplantationen zwar mit einer deutlich geringeren Komplikationsrate, aber auch höheren Zahlen an gemischten Chimärismen und drohenden Abstoßungen verknüpft. Darüber hinaus ist die Verfügbarkeit einer*s Geschwister- oder auch Fremdspenders*in insgesamt deutlich zu gering, um einer ausreichenden Anzahl an Patient*innen eine kurative Therapie zu bieten. Die haploidente Transplantation zeigt zunehmend bessere Ergebnisse und bietet den Vorteil einer besseren und schnelleren Spender*innen-Verfügbarkeit. Sie birgt jedoch auch neue Risiken und stellt insbesondere höhere Ansprüche an die Transplantationsvorbereitung. Viren, wie HHV-6 können den Transplantationsverlauf massiv verkomplizieren. Eine erweitere Spender*innen-Voruntersuchung und Empfänger*innen-Vorbereitung ist unerlässlich. Da die Sichelzellkrankheit mit einer chronisch-progredienten Organtoxizität einhergeht, sind für ältere Patient*innen schwerwiegendere Komplikationen zu erwarten. Konzepte zur optimierten Vorbereitung (inklusive Erythrozyten-Austausch, HLA-Antikörperelimination, Darmdekontamination) sollten als essentieller Bestandteil der Transplantation verstanden werden. Außerdem wird versucht, die Transplantationstoxizität zu verringern. Ob eine Antikörper-basierte Konditionierung in Kombination mit einer korrigierenden Gentherapie die Antwort sowohl auf die Frage der Toxizitätsreduktion als auch der Spender*innen-Auswahl ist, wird die Zukunft zeigen

Die Expression der ABC-Transporter MRP4 und MRP5 in den hämatopoetischen Vorstufen der myeloiden Reihe

Viele periphere Blutzellen exprimieren ABC-Transporter an ihrer Zelloberfläche. Insbesondere konnten ABCC4 (MRP4) und ABCC5 (MRP5), die in Plasmamembranen verschiedener peripherer Blutzellen identifiziert wurden, spezifische Funktionen für die entsprechenden Zellpopulationen, wie z.B. die Mediatorspeicherung in den dichten Granula der Thrombozyten zugewiesen werden. Alle reifen Blutzellen stammen von derselben Stammzelle ab, sodass man annehmen muss, dass sich die spezifische Funktionalität und die dazugehörige zelluläre Ausstattung erst im Verlauf der Differenzierung ausbilden. Inwiefern sich diese Prozesse während der Differenzierung auf die Expression und Lokalisation von MRP4 und MRP5 auswirken, wurde bisher nicht untersucht. So wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Zellmodell zur Isolierung CD34-positiver hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut entwickelt. Dies beinhaltete zudem die Behandlung CD34-positiver Zellen mit bestimmten Wachstumsfaktoren zur Differenzierung in die thrombozytäre und die myelomonozytäre Richtung. Darüber hinaus wurden die Leukämiezelllinien K562 und HL60 mit PMA, DMSO und Butyrat ausdifferenziert. Erstere in Richtung Thrombozyten, letztere in Richtung Makrophagen, Granulozyten und Monozyten. Der Differenzierungsnachweis wurde mittels FACS-Analyse geführt und die Expression von MRP4 und MRP5 im Anschluss auf mRNA und Protein-Ebene, mittels Real-Time PCR, Immunhistochemie, Western Blot und Akkumulationsassay erforscht. In den thrombozytär differenzierten CD34-positiven Zellen fand sich ein signifikant positiv korreliertes Verhältnis von MRP4 zu CD41a (Glykoprotein IIb/IIIa), hingegen eine negative Korrelation von MRP5 zu CD41a. Außerdem konnte im Laufe der Differenzierung in der Immunfluoreszenz eine zunehmende intrazelluläre Expression von MRP4 und eine Kolokalisation mit LAMP-2, einem Lysosomen- und Dense-Granula-Marker, gezeigt werden. Die myelomonozytären Zellen wiesen eine signifikante Reduktion an MRP4 und ebenfalls eine Verminderung der MRP5-Expression auf. In der Differenzierung der leukämischen Zelllinien wurde eine generelle Zunahme von MRP4 und MRP5 mit der Entdifferenzierung der Zellen in allen Linien gefunden. Die komplexen Vorgänge im Verlauf der menschlichen Hämatopoese umfassen also auch Veränderungen an MRP4- und MRP5-Expression in Qualität und Quantität. Sowohl in der physiologischen als auch in der pathologischen Zellentwicklung findet sich eine Regulation dieser beiden Transporter. Die Ergebnisse der Arbeit stützen die Annahme, dass MRP4 eine wichtige Rolle im Metabolismus der Thrombozyten spielt, hier besonders in der Speicherung und Freisetzung von cGMP, ADP und Serotonin. Die Transporterexpression in den Leukämiezelllinien steigt mit der Entdifferenzierung der Zellen. Aus dieser Erkenntnis ergeben sich therapeutische Überlegungen, Differenzierungsagenzien zur Überwindung der Multi-Drug-Resistenz mit Chemotherapeutika zu kombinieren.Many peripheral blood cells express ABC-transporters on their surface. Especially for MRP4 and MRP5, identified on plasma membranes of several peripheral blood cells, different specific tasks were found, e.g. mediator storage in thrombocytic dense granules. All mature blood cells derive from the same stem cell, so the different cell functions and the specific equipment are thought of to be developed during differentiation. The impact of these processes on expression and localization of MRP4 and MRP5 has not been investigated yet. Here, a cell modell was established for isolation of CD34 positive hematopoietic stem cells from cord blood. Separation was followed by differentiation towards the myelomonocytic and thrombocytic lineage with growth factors. Moreover, leukemic cell lines, HL60 and K562, were differentiated with PMA, DMSO and Butyrate towards granulocytes and megakaryocytes, respectively. Differentiation was proved by FACS-analysis and expression and localization of MRP4 and 5 was investigated using real-time PCR, immunostaining, western blotting and an accumulation assay. A significant positive correlation of MRP4-expression and CD41a-positivity (glycoprotein 2b/3a) was found in the thrombocytic lineage, whereas MRP5-expression was negatively correlated to CD41a. An intracellular signal, co-localized to LAMP-2 (dense-granule and lysosomal marker) was also found in thrombocytic differentiated cells. MRP4 and MRP5-expression in the myelomonocytic cells decreased with differentiation. For the leukemic cell lines a general increase of MRP4 and MRP5-expression was found with de-differentiation of the cells. Consequently, these transporters are differentially regulated during hematopoiesis in quality and quantity. These findings support the assumption that MRP4 plays an important role in thrombocytic metabolism, especially in mediator storage of cGMP, ADP and serotonin. Expression of transporters in the leukemic cell lines increases with de-differentiation. These findings lead to the therapeutic option of combining differentiation agents with chemotherapy to overcome multidrug resistance