СИНТЕЗ ГИДРОФИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ 11,11-D2-ЛИНОЛЕВОЙ КИСЛОТЫ

Previously it was shown that 11,11-D2-linoleic acid effectively quenches the processes of lipid peroxidation in vitro and in cell cultures due to the presence of reinforced C-D bonds in bis-allylic positions, which are most vulnerable to the radicals. Therefore, this compound serves as a promising candidate to treat mitochondrial and eye diseases. The present work deals with the synthesis of the hydrophilic derivatives of 11,11-D2-linoleic acid as prodrug forms with increased solubility in water and biological media and improved pharmacological properties. As modifying reagents, we chose biologically compatible natural compounds, mainly aminoacids, which were attached to 11,11-D2-linoleic acid via amide or ester bond. Among the synthesized compounds there are cationic, anionic and neutral derivatives, and their permeability in eyes will be further tested. Ранее показано, что 11,11-D2-линолевая кислота эффективно подавляет процессы липидного окисления in vitro и в клеточных культурах за счет наличия в ее структуре «усиленных» С-D-связей в бис-аллильных положениях, наиболее чувствительных к действию радикалов. Как следствие, это соединение является перспективным кандидатом в терапии митохондриальных и глазных заболеваний. В данной работе решается задача синтеза гидрофильных производных 11,11-D2-линолевой кислоты, которые могут служить ее пролекарственными формами с увеличенной растворимостью в воде и биологических средах и улучшенными фармакологическими параметрами. В качестве модифицирующих реагентов мы выбрали биологически совместимые природные соединения, преимущественно аминокислоты, присоединяемые к 11,11-D2-линолевой кислоте амидной или сложноэфирной связью. Среди полученных соединений присутствуют катионные, анионные и незаряженные производные, которые в дальнейшем планируется испытать на их способность проникать к сетчатке глаза.

СИНТЕЗ ДЕЙТЕРИРОВАННОГО МЕТИЛХЛОРФОРМИАТА

Most analytical methods in metabolomics allow determination of relative intensities or require several internal standards of metabolites. For quantitative analysis, determination of absolute concentrations is required. For this purpose, the gas chromatography/tandem mass spectrometry methods are used, based on methyl chloroformate derivatization and quantification by spiking samples with metabolite standards separately derivatized with deuterated derivatization reagents. Described herein is the synthesis of deuterated methyl chloroformate – the reagent for absolute quantitative metabolite analysis by gas chromatography-mass spectrometry. The method allows preparation and isolation of deuteromethylchloroformate with high yields.Большинство аналитических методов метаболомики позволяют определить относительное содержание метаболитов в биологических образцах, либо требуют использования нескольких внутренних стандартов. Для количественного определения метаболитов необходимо определение абсолютных концентраций. Для этих целей применяютсягазохроматографические методы разделения продуктов взаимодействия метаболитов с метилхлорформиатом и их масс-детекция с использованием дейтерированных аналогов в качестве внутренних стандартов. Нами синтезирован дейтерированный метилхлорформиат – реагент для абсолютного количественного метаболомического анализа на основе газовой хроматографии с масс-детекцией. Предложенный метод позволяет получать дейтерометилхлорформиат в индивидуальном состоянии с высокими выходами

Производные поли(этиленгликоля) в синтезе водорастворимого цианинового красителя Су5

An effective method for the preparation of water-soluble cyanine dye Cy5 using the soluble polymers supported liquid-phase organic synthesis (LPOS) was proposed. Poly (ethylene glycol) methyl ether with a molecular weight of 2000 was used as a polymer substrate, which allowed us to simplify the characterization of products at intermediate stages of synthesis by NMR spectroscopy. This approach makes it easy to obtain the necessary cyanine dyes, which are widely used as fluorescent labels and are popular modifying reagents in biochemistry and medicine.Предложен эффективный метод получения водорастворимого цианинового красителя Су5 при помощи жидкофазного синтеза на водорастворимых полимерных носителях (ЖСВП). В качестве полимерной подложки использовали метиловый эфир поли(этиленгликоля) с молекулярной массой 2000, что позволило упростить процесс характеризации продуктов на промежуточных стадиях синтеза ЯМР-спектроскопией. Данный подход позволяет легко получить необходимые цианиновые красители, которые широко используются в качестве флуоресцентных меток и являются востребованными модифицирующими реагентами в биохимии и медицине

ПОЛУЧЕНИЕ БЕЛКОВЫХ КОНЪЮГАТОВ И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ТЕТРАЦИКЛИНА

We report herein on the methods to introduce a desirable number of modifications into bovine serum albumin and horseradish peroxidase in a controlled manner. The low modification to protein ratio is required when the biological activity of the enzyme has to be preserved, and the high modification to protein ratio is needed when producing immunogens. By varying the linker and the site of antigen binding with the carrier protein, we were able to produce the antibodies of high specificity. Protein conjugates of tetracycline were synthesized and characterized. Immunization of mice was carried out and monoclonal antibodies for immunoassay of tetracycline were obtained and tested in ELISA, IC50=5 ug/ml. Разработаны методы контролируемой химической модификации бычьего сывороточного альбумина и пероксидазы хрена, позволяющие вводить в белок как минимальное число модификаций для сохранения биологической активности в иммуноанализе, так и максимальное – для получения иммуногенов, а также варьировать линкер и сайт связывания антигена с белком для повышения специфичности иммунного ответа. Получены и охарактеризованы белковые конъюгаты тетрациклина. Проведена иммунизация мышей, выделены моноклональные антитела к тетрациклину, которые испытаны в иммуноферментном анализе тетрациклина. Чувствительность определения составила IC50=5 мкг/мл.

КОНТРОЛИРУЕМОЕ ПЕГИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ АЗИДНЫМИ РЕАГЕНТАМИ-РАЗВЕТВИТЕЛЯМИ С ПОМОЩЬЮ КЛИК-ХИМИИ

Polyethyleneglycol (PEG) is nontoxic, nonimmunogenic, hydrophilic, chargeless and nonbiodegradable poliymer. Its usage as a part of therapeutics protein drugs is common in medicine practice. It is known that covalent attachment of PEG conduces to prolong blood circulation half-lives, improves drug solubility and stability and reduces immunogenicity. It allows optimizing pharmacodynamic and pharmacokinetic drug properties. The goal of structure optimization of therapeutic proteins conjugates with PEG is to reduce loss of biological activity. It can be reached through controlled site- specific pegylation. We introduce two-step modification of proteins with branched polyethylenglycols via click-chemistry, synthesis of branched PEG azide reagent on the base of tris(hydroxymethyl)aminomethane with three linear PEG polymers. At first, we introduce alkyne groups with NHS-ester of alkyne acid in BSA protein. Then, branched PEG azide reagent reacts with alkyne function via CuAAC. Purification of the conjugates was done via gel-chromotography. Number of modifications was calculated from MALDI mass-spectra.Полиэтиленгликоль (ПЭГ) является нетоксичным, неиммуногенным, гидрофильным, незаряженным и бионеразлагаемым полимером, и его использование в составе терапевтических белковых препаратов вошло в медицинскую практику. Известно, что ПЭГ, соединенный с терапевтическим белком, способствует более длительному нахождению препарата в организме, снижает его иммуногенность и антигенность, повышает растворимость и стабильность в биологических средах, что позволяет оптимизировать фармакокинетические свойства препарата. Одной из целей оптимизации структуры конъюгатов терапевтических белков с ПЭГом является максимальное сохранение биологической активности белка, что может быть достигнуто с помощью контролируемого пегилирования по заданным сайтам белковой молекулы. В настоящей работе представлен метод двухстадийной модификации белков разветвленными полиэтиленгликолями с использованием реакции [3+2] диполярного циклоприсоединения азидов к алкинам. Описан синтез азидного реагента-разветвителя на основе трис(гидроксиметил)аминометана, содержащего три остатка полиэтиленгликоля. Разработана методика двухстадийной модификации модельного белка бычь- его сывороточного альбумина, включающая введение на первой стадии алкиновых групп при помощи N-гидро- ксисукцинимидного эфира алкинокислоты, которые затем вступают в «клик»-реакцию с азидным пегилирующим реагентом-разветвителем. Полученные конъюгаты выделены с помощью гельпроникающей хроматографии. Число введенных модификаций определено при помощи МАЛДИ масс-спектрометрии

Конъюгация наночастиц магнетита с олигонуклеотидами для магнитной доставки онколитической РНК

The synthesis of magnetic nanoparticles conjugated with oligonucleotides has been described. The conjugates prepared were used for immobilization of the model oligonucleotide sequence imitating the oncolytic RNA strand fragment.Описано получение конъюгатов олигонуклеотидов с наночастицами магнетита. Синтезированные конъюга-ты использовали для иммобилизации модельной последовательности, соответствующей фрагменту онколитической РНК

СИНТЕЗ КОНЪЮГАТОВ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С ПРОИЗВОДНЫМИ 11,11-D2-ЛИНОЛЕВОЙ КИСЛОТЫ ПО РЕАКЦИИ АЗИД-АЛКИНОВОГО ЦИКЛОПРИСОЕДИНЕНИЯ

A new approach to the synthesis of oligonucleotide-fatty acid conjugates is reported. It is based on Cu-catalyzed reaction between azide oligonucleotides and fatty acid derivatives with terminal triple bond (CuAAC). To demonstrate this approach, five derivatives of 11,11-D2-linoleic acid containing terminal alkyne group at different parts of the molecule were synthesized. A method of conjugation of alkyne 11,11-D2-linoleic acid with azide oligonucleotide T20 is developed, and the conditions (time, concentration of Cu catalyst, excess of alkyne reagent, composition of the solvent, etc.) are optimized. These conjugates are stable in biological media, have increased permeability through the cell membranes and can be used in gene therapy. Предложен новый подход к синтезу конъюгатов олигонуклеотидов и жирных кислот, основанный на медь-катализируемой реакции циклоприсоединения азидсодержащих олигонуклеотидов к производным жирных кислот с терминальной тройной связью (CuAAC). Для демонстрации этого подхода осуществлен синтез пяти производных 11,11-D2-линолевой кислоты, содержащих концевую тройную связь в различных частях молекулы. Разработана методика их конъюгации с азидсодержащим модельным олигонуклеотидом Т20, проверено влияние различных условий (времени, концентрации катализатора, избытка алкинсодержащего реагента, состава растворителя и др.) на выход продукта. Такие конъюгаты устойчивы в биологических средах, обладают повышенной способностью проникать в клетки и могут найти применение в качестве средств генной терапии.

Иммуноферментный анализ метаболитов витамина D3

We report herein improved version of the synthesis of hapten based on cholecalciferol and its active metabolite 25-hydroxycholecalcalferol. The methodology of obtaining high-molecular immunogenic conjugates of vitamin D3 derivatives with bovine serum albumin and horseradish peroxidase conjugates for direct ELISA was optimized. Immunisation of rabbits was carried out and polyclonal antibodies to 25-hydroxycholecalceferol were obtained and tested in an enzyme-linked immunosorbent assay. To improve the accuracy of the method, the sample preparation procedure was optimized, including the release of vitamin D3 and its active metabolites from complexes with vitamin D-binding protein.Описан улучшенный вариант синтеза гаптена на основе холекальциферола и его активного метаболита 25-гидроксихолекальцеферола. Оптимизирована методика получения высокомолекулярных иммуногенных конъюгатов производных витамина D3 с бычьим сывороточным альбумином, а также конъюгатов с пероксидазой хрена для прямого ИФА. Проведена иммунизация кроликов, выделены поликлональные антитела к 25-гидроксихолекальцеферолу, которые испытаны в иммуноферментном анализе. Для повышения точности метода оптимизирован процесс пробоподготовки, включающий высвобождение витамина D3 и его активных метаболитов из комплексов с витамин D-связывающим белком

Оптимизация технологии получения направляющих РНК на планшетном автоматическом синтезаторе

A synthetic protocol was developed and optimal reagents have been selected for obtaining guide RNA oligonucleotides for the CRISPR/Cas system using ASM-2000 automatic synthesizer in 500 nmol scale. Methods for the isolation, purification and analytical control of synthetic RNA oligonucleotides have been developed. The improved technology has been used for preparation of guide RNAs for the CRISPR Cas12a system.Разработан протокол синтеза и подобраны подходящие реагенты для получения направляющих РНК-олигонуклеотидов для системы CRISPR/Cas на автоматическом синтезаторе ASM-2000 в масштабе 500 нмоль. Отработаны методики выделения, очистки и аналитического контроля синтетических РНК-олигонуклеотидов. С использованием улучшенной технологии получены олигонуклеотиды, являющиеся направляющими РНК для системы CRISPR Cas12a

Collins and Sivers transverse-spin asymmetries in inclusive muoproduction of ρ0\rho^0 mesons

The production of vector mesons in deep inelastic scattering is an interesting yet scarsely explored channel to study the transverse spin structure of the nucleon and the related phenomena. The COMPASS collaboration has performed the first measurement of the Collins and Sivers asymmetries for inclusively produced $\rho^0$ mesons. The analysis is based on the data set collected in deep inelastic scattering in $2010$ using a $160\,\,\rm{GeV}/c$ $\mu^+$ beam impinging on a transversely polarized $\rm{NH}_3$ target. The $\rho^{0}$ mesons are selected from oppositely charged hadron pairs, and the asymmetries are extracted as a function of the Bjorken-$x$ variable, the transverse momentum of the pair and the fraction of the energy $z$ carried by the pair. Indications for positive Collins and Sivers asymmetries are observed