Unraveling the antifungal activity of a South American rattlesnake toxin crotamine

Crotamine is a highly basic peptide from the venom of Crotalus durissus terrificus rattlesnake. Its common gene ancestry and structural similarity with the beta-defensins, mainly due to an identical disulfide bond pattern, stimulated us to assess the antimicrobial properties of native, recombinant, and chemically synthesized crotamine. Antimicrobial activities against standard strains and clinical isolates were analyzed by the colorimetric microdilution method showing a weak antibacterial activity against both Gram-positive and Gram-negative bacteria [MIC (Minimum Inhibitory Concentration) of 50->200 mu g/mL], with the exception of Micrococcus luteus [MIC ranging from 1 to 2 mu g/mL]. No detectable activity was observed for the filamentous fungus Aspergillus fumigatus and Trichophyton rubrum at concentrations up to 125 mu g/mL. However, a pronounced antifungal activity against Candida spp., Trichosporon spp., and Cryptococcus neoformans [12.5-50.0 mu g/mL] was observed. Chemically produced synthetic crotamine in general displayed MIC values similar to those observed for native crotamine, whereas recombinant crotamine was overridingly more potent in most assays. On the other hand, derived short linear peptides were not very effective apart from a few exceptions. Pronounced ultrastructure alteration in Candida albicans elicited by crotamine was observed by electron microscopy analyses. the peculiar specificity for highly proliferating cells was confirmed here showing potential low cytotoxic effect of crotamine against nontumoral mammal cell lines (HEK293, PC12, and primary culture astrocyte cells) compared to tumoral B16F10 cells, and no hemolytic activity was observed. Taken together these results suggest that, at low concentration, crotamine is a potentially valuable anti-yeast or candicidal agent, with low harmful effects on normal mammal cells, justifying further studies on its mechanisms of action aiming medical and industrial applications. (C) 2012 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)University of Maryland Baltimore County Designated Research Initiative FundUniversidade Federal de São Paulo UNIFESP, Dept Farmacol, BR-04044020 São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo UNIFESP, Dept Med, BR-04044020 São Paulo, BrazilUniv São Paulo, Dept Bioquim & Imunol, BR-14049 Ribeirao Preto, BrazilUniv Maryland, Sch Med, Inst Human Virol, Baltimore, MD 21201 USAUniv Maryland, Dept Biochem & Mol Biol, Baltimore, MD 21201 USAUniversidade Federal de São Paulo UNIFESP, Dept Bioquim, BR-04044020 São Paulo, BrazilInst Butantan, Lab Bioquim & Biofis, BR-05503900 São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo UNIFESP, Dept Ginecol, BR-04044020 São Paulo, BrazilCBA, Lab Bioquim & Biol Mol, Manaus, Amazonas, BrazilUniv Maryland Baltimore Cty, Dept Chem & Biochem, Baltimore, MD 21250 USAInst Butantan, Ctr Toxinol Aplicada CAT CEPID, BR-05503900 São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo UNIFESP, Dept Farmacol, BR-04044020 São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo UNIFESP, Dept Med, BR-04044020 São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo UNIFESP, Dept Bioquim, BR-04044020 São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo UNIFESP, Dept Ginecol, BR-04044020 São Paulo, BrazilWeb of Scienc

Influence of heparin on accelerating the hydrolysis of the tissue inhibitor of metalloproteases 1 (TIMP-1) by human neutrophil elastase (HNE)

A heparina tem sido descrita como capaz de regular a atividade da Elastase de neutrofilo humano (HNE). Neste trabalho avaliamos o efeito regulatorio da heparina sobre a hidrolise do Inibidor Tecidual de Metaloprotease-1 (TIMP-1) pela HNE; para tal correlacionamos dados obtidos com a hidrolise do TIMP-1 recombinante confrontada com dados cineticos da hidrolise do peptideo FRET que compreende a ligacao peptidica hidrolisada pela HNE. A heparina acelera em 2,5 vezes a velocidade de hidrolise do TIMP-1 pela HNE, os parametros cineticos desta reacao foram monitorados com o uso do peptideo FRET em cineticas enzimaticas de equilibrio rapido com um sistema de stopped-flow. Esses experimentos mostram que a hidrolise do peptideo apresenta um burst inicial antes de atingir o equilibrio no estado estacionario, verificamos que a taxa de acilacao da enzima (k2 = 21 ± 1 s-1) e muito mais alta que a velocidade de desacilacao (k3 = 0.57 ± 0.05 s-1). A presenca da heparina induz um expressivo efeito nesta fase, induzindo uma fase lag na hidrolise do peptideo pela HNE. A analise dos dados das constantes cineticas por stopped-flow demonstram que a heparina afeta todas as etapas da reacao enzimatica e resulta no aumento da concentracao do complexo enzima-substrato (ES), por aumentar em 2,4 vezes o k1 e reduzir em 3,1 vezes o k-1, alem de reduzir em 7,8 vezes o valor do k2 enquanto o valor do k3 aumenta em 58 vezes, na presenca da heparina. Esses resultados demonstram claramente que a ligacao da heparina acelera a etapa de desacilacao, bem como, reduz a velocidade da etapa de acilacao. A heparina ainda desloca o pH otimo de atividade da HNE para a direita permitindo assim que a HNE atue em um pH mais alcalino. O docking molecular e as analises cineticas sugerem que a heparina induz mudancas na conformacao espacial da HNE. Neste trabalho descrevemos pela primeira vez que a heparina e capaz de acelerar a hidrolise do TIMP-1, esta degradacao e associada a diversos estados fisiopatologicos relevantes envolvendo a ativacao exacerbada das MMPsBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe