Genomic, proteomic and virulence characterization of clinical isolations of Crytococcus neoformans var. grubii : effect of iron and copper

Tesis inédita de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Farmacia, leída el 08-10-2021Durante el desarrollo de la enfermedad fúngica invasiva (EFI), los metales participan de manera importante en la interacción entre los hongos y las células del hospedero: el hierro y el cobre actúan como cofactores en múltiples reacciones enzimáticas. Estos metales en la célula fúngica se relacionan de manera importante con la expresión de factores de virulencia gobernados por metaloproteasas [1,2]. Por otro lado, en el hospedero, son esenciales en la respuesta eficiente de mecanismos efectores, por ejemplo, en las células del sistema inmunológico. Por lo tanto, el éxito en el establecimiento de la EFI pude depender de la capacidad para competir y adquirir metales del entorno del hospedero [3,4].La levadura ambiental C. neoformans forma parte del complejo de especies que causa la criptococosis, una micosis oportunista adquirida por la inhalación de propágulos fúngicos presentes en el ambiente. Es una infección potencialmente fatal que afecta los pulmones y el sistema nervioso central [5]. Esta levadura produce infecciones frecuentemente en individuos inmunocomprometidos, por ejemplo, en pacientes con SIDA, con trasplante de órganos o con terapias inmunosupresoras...During invasive fungal disease (IFD) development, metals play an important role in the interaction between fungi and host cells, iron, and copper act as cofactors in multiple enzymatic reactions. These metals in the fungal cell are associated to the expression of virulence factors governed by metalloproteases [1,2]. On the other hand, in the host, they are essential in the efficient response of effector mechanisms, for example, in cells of the immune system. Therefore, the success of IFD establishment may depend on the ability to acquire and compete for metals from the host environment [3,4].The environmental yeast C. neoformans is part of the species complex that causes cryptococcosis, an opportunistic mycosis, acquired by inhalation of fungal propagules present in the environment. It´s a potentially fatal infection that affects the lungs and central nervous system [5]. This yeast frequently affects immunocompromised individuals, for example, in patients with AIDS, organ transplants, or immunosuppressive therapies...Fac. de FarmaciaTRUEunpu

Pore-forming peptide C14R exhibits potent antifungal activity against clinical isolates of Candida albicans and Candida auris

IntroductionInvasive candidiasis is a global public health problem as it poses a significant threat in hospital-settings. The aim of this study was to evaluate C14R, an analog derived from peptide BP100, as a potential antimicrobial peptide against the prevalent opportunistic yeast Candida albicans and the emergent multidrug-resistant yeast Candida auris.MethodsAntifungal susceptibility testing of C14R against 99 C. albicans and 105 C. auris clinical isolates from Colombia, was determined by broth microdilution. Fluconazole was used as a control antifungal. The synergy between C14R and fluconazole was assessed in resistant isolates. Assays against fungal biofilm and growth curves were also carried out. Morphological alterations of yeast cell surface were evaluated by scanning electron microscopy. A permeability assay verified the pore-forming ability of C14R.ResultsC. albicans and C. auris isolates had a geometric mean MIC against C14R of 4.42 µg/ml and 5.34 µg/ml, respectively. Notably, none of the isolates of any species exhibited growth at the highest evaluated peptide concentration (200 µg/ml). Synergistic effects were observed when combining the peptide and fluconazole. C14R affects biofilm and growth of C. albicans and C. auris. Cell membrane disruptions were observed in both species after treatment with the peptide. It was confirmed that C14R form pores in C. albicans’ membrane.DiscussionC14R has a potent antifungal activity against a large set of clinical isolates of both C. albicans and C. auris, showing its capacity to disrupt Candida membranes. This antifungal activity remains consistent across isolates regardless of their clinical source. Furthermore, the absence of correlation between MICs to C14R and resistance to fluconazole indicates the peptide’s potential effectiveness against fluconazole-resistant strains. Our results suggest the potential of C14R, a pore-forming peptide, as a treatment option for fungal infections, such as invasive candidiasis, including fluconazole and amphotericin B -resistant strains

Genomic, proteomic and virulence characterization of clinical isolations of Cryptococcus neoformans var. Grubii : effect of iron and copper

Caracterización genómica, proteómica y de la virulencia de aislamientos clínicos de Cryptococcus neoformans var. grubii: efecto del hierro y el cobre. Introducción Durante el desarrollo de la enfermedad fúngica invasiva (EFI), los metales participan de manera importante en la interacción entre los hongos y las células del hospedero: el hierro y el cobre actúan como cofactores en múltiples reacciones enzimáticas. Estos metales en la célula fúngica se relacionan de manera importante con la expresión de factores de virulencia gobernados por metaloproteasas. Por otro lado, en el hospedero, son esenciales en la respuesta eficiente de mecanismos efectores, por ejemplo, en las células del sistema inmunológico. Por lo tanto, el éxito en el establecimiento de la EFI pude depender de la capacidad para competir y adquirir metales del entorno del hospedero. La levadura ambiental C. neoformans forma parte del complejo de especies que causa la criptococosis, una micosis oportunista adquirida por la inhalación de propágulos fúngicos presentes en el ambiente. Es una infección potencialmente fatal que afecta los pulmones y el sistema nervioso central. Esta levadura produce infecciones frecuentemente en individuos inmunocomprometidos, por ejemplo, en pacientes con SIDA, con trasplante de órganos o con terapias inmunosupresoras. Los metales son necesarios para las funciones esenciales celulares y los hongos patógenos han desarrollado maquinarias para equilibrar con precisión la delgada línea entre la adquisición de metales esenciales y la defensa contra la toxicidad de estos. El suministro de estos metales dependiendo del ambiente en que se encuentre la levadura puede ser limitado, por ejemplo, el hierro disponible en hospederos mamíferos es extremadamente bajo y en la naturaleza los óxidos de hierro se forman por pH bajos donde la disolución es extremadamente lenta y es dada por la concentración de oxígeno. Asimismo, el cobre en la naturaleza no se encuentra totalmente disponible, ya que en pH básicos disminuye. Este metal normalmente esta enlazado con la materia orgánica y en hospederos mamíferos es limitado. En Cryptococcus neoformans, una de las funciones que desempeñan los metales como el hierro y el cobre es la regulación de la expresión de factores de virulencia como la cápsula o la producción de melanina, por lo que influyen en la infección sistémica exitosa. Objetivo En principal objetivo de esta tesis es caracterizar el genotipo, la virulencia, el proteoma y el efecto del hierro y del cobre sobre la modulación de la patogenicidad en 29 aislamientos clínicos colombianos de Cryptococcus neoformans var. grubii, con el fin de entender su implicación en la virulencia y aportar nuevos datos que ayuden a la predicción de nuevas dianas antifúngicas. Resultados 1. Caracterización genotípica, determinación de la variabilidad patogénica, crecimiento capsular, producción de melanina, suceptibilidad antifúngica y variantes no sinónimas de genes asociados, en aislamientos clínicos. Se genotiparon 29 aislamientos clínicos de C. neoformans var. grubii utilizando el esquema de MLST identificándose 11 secuencias tipo (ST), siendo la ST69 la más frecuente seguida de ST2, ST93 y ST377. A continuación, se evaluó la patogenicidad de los aislamientos en G. mellonella clasificándolas en patogenicidad alta (12), intermedia (10) y baja (7) y se llevó a cabo el análisis de los principales factores de virulencia, como efecto en la cápsula pre y post inoculación en G. mellonella, inducción de la cápsula en MOPS y pigmentación de melanina en L-Dopa. En general en los aislamientos con baja patogenicidad se observaron cápsulas de mayor tamaño (1.730 μm de promedio) respecto a los de alta (0.630 μm) y de intermedia (0.498 μm) patogenicidad. De los 7 aislamientos categorizados con baja patogenicidad se observaron 3 con baja pigmentación, 2 intermedia y 2 con alta pigmentación. También dentro de los aislamientos de alta patogenicidad se incluían aislamientos con todos los niveles de pigmentación, 4 de baja, 3 de intermedia y 5 de alta. Posteriormente, se investigó si con el estudio de las características fenotípicas observadas es posible clasificar los aislamientos clínicos de acuerdo con su patogenicidad. Para ello, se realizó un análisis de componentes principales utilizando las variables de mortalidad, cápsula y pigmentación de melanina, encontrándose relación entre el aumento del tamaño capsular y los aislamientos clasificados como de alta patogenicidad. Además, los aislamientos que se agruparon en las secuencias tipo más frecuentes como la ST69 y ST95 presentaron cápsulas grandes (X:2.42 μm), mientras que los aislamientos de la ST2 y ST377 presentaron cápsulas pequeñas (X:1.03 μm). Seguidamente, se combinaron los datos obtenidos de las variables fenotípicas con genes asociados a los principales factores de virulencia. Tras la secuenciación del genoma completo de los 29 aislamientos clínicos y el análisis de polimorfismos (SNPs) se determinaron 48 variantes no sinónimas asociadas a los fenotipos observados y ubicadas en los dominios funcionales predichos para 39 genes. Entre ellas, se identificaron 48 variantes no sinónimas ubicadas en genes asociados a cápsula, melanina y patogenicidad como PTP1, PMT4, IPK1, PBX2, OVA1 y ROM2; además, en 9 de estos genes los cambios detectados implicaban la aparición de codones de parada. 2. Efecto de hierro y cobre en la patogenicidad, el tamaño capsular y producción de melanina en aislamientos clínicos de alta y baja patogenicidad. En la segunda parte de la tesis se exploró el efecto de hierro y cobre en el crecimiento de aislamientos clínicos de C. neoformans var. grubii, en su patogenicidad en G. mellonella, el crecimiento capsular y la pigmentación de melanina. La levadura fue capaz de crecer a concentraciones de hasta 50 μM de hierro y 500 μM de cobre. A continuación, se evaluó la patogenicidad tras el precultivo con hierro y cobre de 10 aislamientos clínicos con diferentes perfiles de patogenicidad basal (sin precultivo con los metales). En el 90 % de los aislamientos aumento la patogenicidad con la combinación de 50+500 μM de hierro y cobre respectivamente. Igualmente, se observó un aumento del crecimiento de la cápsula, se aceleró la producción de melanina y se indujo la aparición de células tipo titán. 3. Análisis proteómico de los cambios inducidos por el hierro y el cobre y determinación de variantes genéticas en genes asociados a estos metales en dos asilamientos de baja y alta patogenicidad. Finalmente, para obtener información de los mecanismos implicados en los rasgos de virulencia inducidos en la combinación con 50 μM hierro y 500 μM de cobre, se realizó un análisis proteómico comparativo de extractos citoplasmático de dos aislamientos clínicos (H0058-I-2807 y H0058-I-3102) con diferente grado de patogenicidad tras su crecimiento en con dichos metales y sin ellos. En el precultivo de 50+500 μM de hierro y cobre se identificaron 1.484 proteínas en el aislamiento clasificado como de baja patogenicidad y 1.549 para el aislamiento de alta patogenicidad. Se detectaron 147 proteínas diferenciales que fueron específicas del precultivo con los metales en los dos aislamientos. Las proteínas diferenciales en el aislamiento de alta. patogenicidad fueron 130 (88 aumentaron y 42 disminuyeron su abundancia) y 198 en el aislamiento de baja patogenicidad (149 aumentaron y 49 disminuyeron su abundancia). Finalmente se detectaron 49 proteínas comunes entre los dos aislamientos: 30 con mayor abundancia, 14 con menor y 5 con diferente cambio según el aislamiento. Las proteínas de los dos aislamientos cultivados en la combinación de hierro y cobre que aumentaron su abundancia están relacionadas entre otros procesos con el estrés celular, tráfico vesicular (Ap-1, Vps35), estructura de la pared celular (Och1, Ccr4, Gsk3), biosíntesis de pigmento (Hem15, Mln2), reparación de ADN (Chk1), transporte de proteínas (Mms2), así como proteína asociada a la SUMOilación (Uba2) y un transportador mitocondrial (Atm1). Por lo tanto, la presencia del precultivo con los metales influye sobre la abundancia de proteínas que están involucradas en la patogenicidad. Conclusiones Los aislamientos clínicos colombianos de C. neoformans var. grubii analizados presentaron diferencias en su capacidad patogénica la cual es multifactorial. Cuando se comparan las características demográficas y fenotípicas de acuerdo con las ST identificadas, queda claro que, en lugar de ser un grupo homogéneo, existe una amplia variabilidad tanto en la capacidad patogénica, como en el tamaño capsular y producción de melanina. Quizás las diferencias patogénicas entre los aislamientos obedezcan a las condiciones ambientales en que el hongo crece, el modelo utilizado y a las condiciones propias del hospedero. Los datos sugieren que el incremento del tamaño capsular es una variable clave para la diferenciación de aislamientos más o menos patógenas, independientemente del método empleado para su inducción. Históricamente la cápsula ha sido ampliamente estudiada dada su capacidad para modular la respuesta inmune del hospedero y los cambios morfológicos de esta estructura se han relacionado con resistencia antifúngicos y a condiciones de estrés, por lo que este proceso es importante para evadir la muerte por parte de las células fagocíticas. En el estudio genómico de los 29 aislamientos clínicos se identificaron variantes no sinónimas que implican 9 codones de parada en genes relacionados con el polisacárido capsular, la síntesis de melanina, el crecimiento, el mantenimiento de la pared celular, la secreción de vesículas extracelulares o la respuesta a estrés. Sería interesante ahondar en el estudio de las consecuencias a nivel de secuencia y función de proteína producidos por las variaciones genotípicas detectadas. Responder y adaptarse a una gran cantidad de estímulos ambientales son habilidades claves que necesita C. neoformans para sobrevivir en nichos biológicos diferentes. El metabolismo de hierro y cobre es de gran importancia en la fisiología de esta levadura dado que interviene en distintos procesos biológicos. Esta es la primera investigación en que se combina el hierro y el cobre en el precultivo de aislamientos clínicos de C. neoformans var. grubii. Con esta aproximación, se comprobó que la combinación de estos metales aumentó la patogenicidad, el tamaño capsular, aceleró la producción del pigmento de melanina e indujo células tipo titán. Además, se observaron cambios proteómicos tras el precultivo con la combinación de 50 μM de hierro y 500 μM de cobre. Se detectó un aumento en la abundancia de proteínas relacionadas con respuesta a estrés oxidativo, integridad de pared celular, trafico vesicular, cápsula y melanina. Es interesante resaltar que el marcado aumento de la patogenicidad puede explicarse en parte por los resultados que indican que existe un vínculo entre el precultivo en combinación de hierro y cobre y cambios en proteínas asociadas a la cápsula, melanina, pared celular y tráfico vesicular. Sin embargo, para comprender mejor este proceso y sus mecanismos moleculares en detalle es necesario continuar explorando la dinámica de los metales en la patogenicidad y virulencia en esta levadura.Genomic, proteomic, and virulence characterization of clinical isolates of Cryptococcus neoformans var. grubii: effect of iron and copper. Introduction During invasive fungal disease (IFD) development, metals play an important role in the interaction between fungi and host cells, iron, and copper act as cofactors in multiple enzymatic reactions. These metals in the fungal cell are associated to the expression of virulence factors governed by metalloproteases [1,2]. On the other hand, in the host, they are essential in the efficient response of effector mechanisms, for example, in cells of the immune system. Therefore, the success of IFD establishment may depend on the ability to acquire and compete for metals from the host environment [3,4]. The environmental yeast C. neoformans is part of the species complex that causes cryptococcosis, an opportunistic mycosis, acquired by inhalation of fungal propagules present in the environment. It´s a potentially fatal infection that affects the lungs and central nervous system [5]. This yeast frequently affects immunocompromised individuals, for example, in patients with AIDS, organ transplants, or immunosuppressive therapies [6]. Metals are required for essential cellular functions, and fungal pathogens have developed machinery to precisely balance the fine line between acquiring them and defending against their toxicity [1,3]. The supply of these metals can be limited as it depends on the surrounding environment. For example, the available iron in mammalian hosts is extremely low and in nature iron oxides are formed by low pH where dissolution is extremely slow and is driven by oxygen concentration (in the atmosphere/in the soil). Also, copper is not fully available in nature, since its abundance is decreased in basic pH conditions. This metal is normally bound to organic matter and is limited in mammalian hosts [7]. In Cryptococcus neoformans, one of the functions played by metals such as iron and copper is the regulation of the expression of virulence factors such as capsule or melanin production, thus influencing successful systemic infection [8,9]. Objective The main objective of this thesis was to characterize the genotype, virulence, proteome and the effect of iron and copper on the modulation of pathogenicity in 29 Colombian clinical isolates of Cryptococcus neoformans var. grubii, to understand its implication in virulence and provide new data that may help to predict new antifungal targets. Results 1. Genotypic characterization, determination of pathogenic variability, capsular growth, melanin production, and non-synonymous variants of pathogenesis associated genes in clinical isolates. We genotyped 29 clinical isolates of C. neoformans var. grubii using the MLST scheme, identifying 11 type sequences (ST). ST69 was the most frequent followed by ST2, ST93 and ST377. Next, the pathogenicity of the isolates in G. mellonella was evaluated classifying them as high (12), intermediate (10) and low (7) pathogenicity. Additionally, the main virulence factors were analyzed: effect on the capsule pre and post inoculation in G. mellonella, capsule induction in MOPS and melanin pigmentation in L-Dopa. In general, in isolates with low pathogenicity, larger capsules (1.730 μm on average) were observed compared to those with high (0.630 μm) and intermediate (0.498 μm) pathogenicity. Of the 7 isolates categorized with low pathogenicity, 3 were observed with low pigmentation, 2 intermediate and 2 with high pigmentation. Also, within the high pathogenicity isolates, all levels of pigmentation were included, 4 low, 3 intermediate and 5 high. The possibility to classify clinical isolates according to their observed pathogenesis-related traits was investigated. For this, a principal component analysis was carried out using the variables of mortality, capsule, and melanin pigmentation, finding a relationship between the increase in capsular size and the isolates classified as highly pathogenic. Furthermore, the isolates that were grouped into the most frequent sequence type such as ST69 and ST95 presented larger capsules (X: 2.42 μm), while the isolates of ST2 and ST377 presented small capsules (X: 1.03 μm). Subsequently, the data obtained from the phenotypic variables were combined with genes associated with the main virulence factors. After the sequencing of the complete genome of the 29 clinical isolates and the analysis of polymorphisms (SNPs), 48 non-synonymous variants associated with the observed phenotypes and located in the predicted functional domains for 39 genes were determined associated with capsule, melanin, and pathogenicity, such as PTP1, PMT4, IPK1, PBX2, OVA1 and ROM2, in addition to 9 of these genes the changes detected implied the appearance of stop codons. 2. Effect of iron and copper on pathogenicity, capsular size, and melanin production in high and low pathogenicity clinical isolates. In the second part of the thesis, the effect of iron and copper on the growth of clinical isolates of C. neoformans var. grubii upon its pathogenic potential in G. mellonella, capsular growth, and melanin pigmentation was investigated. The yeast was able to grow at concentrations up to 50 μM of iron and 500 μM of copper. Next, the pathogenicity after preculture with iron and copper of 10 clinical isolates with different baseline pathogenicity profiles (without preculture with metals) was evaluated. In 90% of the isolates, the pathogenicity increased with the combination of 50 μM of iron and copper 500 μM, respectively. Likewise, an increase in capsule growth was observed, melanin production was accelerated, and the appearance of titan-like cells was induced. 3. Proteomic analysis of the changes induced by iron and copper, and determination of genetic variants in genes associated with these metals in two isolates of low and high pathogenicity. Finally, a comparative proteomic analysis of cytoplasmic extracts of two clinical isolates with different degrees of pathogenicity was carried out after growth with and without 50 μM iron plus 500 μM copper. In the pre-enriched preculture, 1484 proteins were identified in the isolate classified as low pathogenicity and 1549 proteins for the isolation of high pathogenicity. Also, 147 proteins specific of the preculture with the metals for the two isolates were detected. Differential proteins in the high pathogenicity isolate amounted to 130 (88 increased and 42 decreased in abundance) and 198 in the low pathogenic isolate (149 increased and 49 decreased in abundance). Finally, 49 common proteins were detected between the two isolates: 30 with the higher abundance, 14 with the lower and 5 with different changes depending on the isolate. Among the proteins that increased their abundance on both isolates when cultured in combination with iron and copper some of them are related to biological processes such as cell stress, vesicular traffic (Ap-1, Vps35), cell wall structure (Och1, Ccr4, Gsk3), pigment biosynthesis (Hem15, Mln2), DNA repair (Chk1), protein transport (Mms2), SUMOylation-associated protein (Uba2), and a mitochondrial transporter (Atm1). Therefore, the presence of metals in preculture influences the abundance of proteins that are involved in pathogenicity. Conclusions Colombian clinical isolates of C. neoformans var. grubii were analyzed and showed differences in their pathogenic capacity, which is multifactorial. When the phenotypic characteristics are compared according to the identified STs, instead of being a homogeneous group, they exhibited wide variability in both pathogenic capacity, capsular size, and melanin production. Perhaps the pathogenic differences between the isolates are due to the environmental conditions in which the fungus grows, the model used, and the host's own conditions. The data suggest that the increase in capsular size is a key variable for the differentiation of pathogenic profiles among isolates, regardless of the method used for its induction. Historically, the capsule has been widely studied given its ability to modulate the host's immune response and morphological changes in this structure have been related to antifungal resistance and stress thus highlighting its importance to avoid death by the phagocytic cells. In the genomic study of the 29 clinical isolates, non-synonymous variants were identified that involved stop codons in genes related to capsular polysaccharide, melanin synthesis, growth, maintenance of the cell wall, secretion of extracellular vesicles, or the stress response. It would be interesting to delve into the consequences at the level of protein sequence and function produced by the genotypic variations detected. Responding and adapting to a large number of environmental stimuli are key skills that C. neoformans needs to survive in different biological niches. The metabolism of iron and copper is of great importance in the physiology of this yeast because it intervenes in different biological processes. This is the first investigation in which iron and copper are combined in the preculture of clinical isolates of C. neoformans var. grubii. With this approach, evidence that the combination of these metals increased pathogenicity, capsular size, accelerated the production of the melanin pigment and induced titanium-like cells is provided. Furthermore, proteomic changes were observed after preculture with the combination of 50 μM iron and 500 μM copper. An increase in the abundance of proteins related to oxidative stress response, cell wall integrity, vesicular traffic, capsule, and melanin was detected. It is interesting to note that the marked increase in pathogenicity can be explained, in part, by the results that indicate that there is a link between the availability of iron and copper and changes in proteins associated with the capsule, melanin, cell wall and vesicular traffic. However, to better understand this process and its molecular mechanisms in detail, it is necessary to continue exploring the dynamics of metals in pathogenicity and virulence in this yeast. It would also be of great interest to include in these investigations various stimuli found by yeast in the different environments where it interacts with the hostDoctor en Ciencias BiológicasDoctoradohttps://orcid.org/ 0000-0003-1013-5470https://scienti.minciencias.gov.co/cvlac/visualizador/generarCurriculoCv.do?cod_rh=0001429858&lang

The Effects of Nature Exposure Therapies on Stress, Depression, and Anxiety Levels: A Systematic Review

Background: Mental well-being plays a pivotal role within the broader spectrum of health and illness, encompassing factors such as stress, depression, and anxiety. Nature-based therapeutic interventions have emerged as a promising approach to addressing these mental health challenges. This study seeks to assess the impact of these interventions on stress, depression, and anxiety levels. Methods: We conducted an extensive search for randomized clinical trials that examined stress, anxiety, and depression levels. The selected studies underwent a rigorous risk-of-bias assessment following the guidelines outlined in the Cochrane Handbook for Systematic Reviews. Results: Our review encompassed findings from eight publications. Among them, two studies measuring cortisol levels revealed significant differences between the pre-test and post-test measurements within the intervention groups. In two studies that employed the Stress Response Inventory, a significant decrease in stress levels was observed within the intervention groups in contrast to the control groups. However, no significant differences were noted in studies that utilized the Restorative Outcome Scale. In the assessment of anxiety and depression levels, three studies employed the Positive and Negative Affect Schedule, while four studies utilized The Profile of Mood States scale; none of these studies demonstrated significant differences. Conclusions: The current body of evidence offers limited support for advocating nature-based therapeutic interventions as a primary approach to reducing stress, depression, and anxiety