Physiological pathway of differentiation of hematopoietic stem cell population into mural cells

Endothelial cells (ECs), which are a major component of blood vessels, have been reported to develop in adulthood from hematopoietic cell populations, especially those of the monocyte lineage. Here we show that mural cells (MCs), another component of blood vessels, develop physiologically during embryogenesis from a hematopoietic stem cell (HSC) population, based on the in vitro culture of HSCs and histological examination of acute myeloid leukemia 1 mutant embryos, which lack HSCs. As in the embryo, HSCs in adult bone marrow differentiate into CD45+CD11b+ cells before differentiating into MCs. Moreover, CD45+CD11b+ cells are composed of two populations, CD11bhigh and CD11blow cells, both of which can differentiate into MCs as well as ECs. Interestingly, in a murine ischemia model, MCs and ECs derived from the CD11blow population had a long-term potential to contribute to the formation of newly developed blood vessels in vivo compared with the CD11high population, which could not. Moreover, injection of the CD11bhigh population induced leaky blood vessels, but the CD11blow population did not. With respect to the permeability of vessels, we found that angiopoietin 1, which is a ligand for Tie2 receptor tyrosine kinase expressed on ECs and is suggested to induce cell adhesion between ECs and MCs, is produced by the CD11blow population and plays a critical role in the formation of nonleaky vessels. These observations suggested that the CD11low cell population serves as a good source of cells for in vivo blood vessel regeneration

Contribution of hematopoietic stem cells in blood vessel formation

Vascular development consists of vasculogenesis and angiogenesis. The system of TIE2-Angiopoietin (Ang) is involved in angiogenesis. TIE2 regulates adhesion and dissociation between endothelial cells and mural cells, and survival, apoptosis, and chemotaxis of endothelial cells. Ang-2, which is produced by endothelial cells under tissue hypoxia, has been suggested to be a key regulator for the initiation of endothelial cell sprouting from pre-existing vessels. Although Ang-2 binds to TIE2, it does not promote activation of TIE2 on endothelial cells. Ang-2 produced from endothelial cells under hypoxia inhibits the binding of Ang-1 to TIE2. On the other hand, Ang-1 promotes activation of TIE2 and adhesion between endothelial cells and mural cells. Therefore, endothelial cells dissociated from mural cells by Ang-2 are free to move to avascular area where oxygen or nutrient is needed. We recently found that hematopoietic stem cells produce Ang-1 and promote chemotaxis and network formation of TIE2-positive endothelial cells. Moreover, hematopoietic stem cells change their fate into mural cell and stabilize the vessel structure. This novel function may be applied clinically to promote neovascularization by transplanting the hematopoietic stem cells at the desired site.Biomedical Reviews 2003; 14: 1-8

がん細胞のがん幹細胞化における分子基盤の解明とその制御

金沢大学医薬保健研究域医学系近年、固形がんは単一のがん細胞集団により形成されているのではなく、多剤耐性能を有するがん幹細胞とそれより分化し過剰増殖するいわゆるがん細胞によって形成されていることが解明されてきた。このことは、がん治療におけるがん退縮後の再発機構にがん幹細胞の貢献性が高いことを示唆し、がん幹細胞をターゲットとしたがん治療法の開発の重要性が考慮される。しかし現在、がん細胞がいかなる分子機序によりがん幹細胞化するのかについては全く不明のままである。そこで、成体内の組織細胞と幹細胞の細胞融合のメカニズムに着目し、がん細胞と、造血幹細胞との細胞融合によるがん細胞のがん幹細胞化の可能性につき検討した。昨年度、試験管内では造血幹細胞とメラノーマ細胞株B16の混合培養により、血液細胞と融合したB16細胞が、10-10^3個で、マウスに腫瘍を形成させることから、この融合がん細胞の悪性化を示したが、本年度は生体内で同様の現象が生じるか否かを検討した。CAT遺伝子をLoxPでサンドイッチにしたコンストラクトの下流にGFPを連結した遺伝子をCAGプロモーターの制御下で発現する発現プラスミドを作成しB16細胞に遺伝子導入した。次にアクチンプロモーター制御下でCreリコンビネースを発現するマウス由来の骨髄を用いて、野生型マウスの骨髄を再構築させたマウスを作製した。このマウスに先のCAT-Floxed-GFPを発現させたB16細胞を移植したところ、一部のB16細胞にGFPを発現する細胞が出現した。このGFP陽性B16細胞を回収し、再度10個の細胞をマウスに移植すると、GFP陽性と陰性のB16細胞による腫瘍形成が誘導された。このことは骨髄細胞と腫瘍細胞が融合した細胞は、非常に僅少の細胞でがんを再構築できることを意味し、これらががん幹細胞としての形質を獲得したことが示唆された。研究課題/領域番号:17659091, 研究期間(年度):2005 – 2006出典：「がん細胞のがん幹細胞化における分子基盤の解明とその制御」研究成果報告書　課題番号17659091（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-17659091/)を加工して作

造血幹細胞の可塑性を誘導する環境因子の同定と再生医療への応用

金沢大学がん進展制御研究所脂肪組織は骨髄と同様、非常に緻密な血管網の構築がなされており、また脂肪組織に存在する間葉系細胞の亜分画は、もちろん脂肪細胞に分化するものの、その他血管内皮細胞や骨格筋細胞や神経細胞などへの分化能を有することがしめされている。しかし、実際に脂肪組織内に存在する際にはこれらの幹細胞は種々の臓器細胞への分化は抑制されており、この脂肪組織中には通常は幹細胞の可塑性を抑制する分子が存在する可能性が示唆される。そこで幹細胞の可塑性の制御を解析する上で、脂肪組織はいい材料となると考えられ脂肪組織の試験管内維持培養系の確立を試みた。その結果、予想しないことに、我々の培養系では脂肪組織から非常に豊富にbeatingする心筋細胞が分化することが判明した。これら心筋細胞はα-sarcomeric proteinやNkh2.5など心筋特異的な細胞骨格分子や転写因子を発現しており、これら培養した心筋細胞が実際、心筋梗塞モデルラットの心臓へ生着し、心筋虚血を改善させることが可能であることが判明した。今回の研究期間ではまだ明らかにすることができなかったが、今後いかなる細胞分画が心筋細胞に分化しうるのか、そして脂肪組織の培養系ではいかなる分子が脂肪組織内のおそらく幹細胞分画と考えられる細胞を心筋細胞へと分化転換させるのかを解明したい。また、前述したように体内に存在する脂肪組織内では心筋細胞に分化を抑制する分子が存在することが予想され、本分子を明確にすることで、この分子の機能抑制により間葉系幹細胞を心筋細胞へ容易に分化させることのできる培養系を樹立し、心筋梗塞など重傷の心疾患に対する新規の治療概念を確立したい。研究課題/領域番号:14657244, 研究期間(年度):2002 – 2003出典：「造血幹細胞の可塑性を誘導する環境因子の同定と再生医療への応用」研究成果報告書　課題番号14657244（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-14657244/)を加工して作

造血幹細胞の発生・自己複製に関わる分子クローニングとその機能解析

金沢大学がん研究所造血幹細胞を用いた再生医療への応用のため、効率のよい幹細胞の試験管内増幅にむけ造血幹細胞の未分化性の維持や自己複製等の幹細胞性の維持の分子機序を我々が以前より造血幹細胞、血管内皮細胞に共に発現し、幹細胞の増殖機構に関与することをそのノックアウトマウスにおいて解明してきたレセプター型チロシンキナーゼTIE2の機能解析を中心に行なった。胎児肝や成体骨髄など造血組織では造血幹細胞の増殖が血管内皮細胞近傍で生じることが明らかになった。これら造血幹細胞はTIE2ばかりでなくTIE2の結合因子アンジオポエチン-1(Ang1)を分泌することが判明した。そこでTIE2が恒常的に活性化するTIE2の変異cDNAを作成しTIE2の詳細な機能を解析した。その結果TIE2の活性化は細胞死の抑制、細胞周期の遅延化、細胞外マトリックスへの細胞接着の増強を誘導することが判明した。さらに、TIE2が活性化する血管内皮細胞と血液細胞は選択的に接着することが明らかになり、造血幹細胞の分泌するAng1が内皮-造血幹細胞間の接着に関与し、これが引き金となり幹細胞の自己複製が誘導されると考察された。以上の研究結果に立脚し、TIE2の活性化により制御をうける分子につきマイクロアレイ法を用いて複数の遺伝子単離に成功した。我々がE11と呼ぶ新規の転写因子は極々の臓器の幹細胞レベルの細胞に発現し、本遺伝子のノックアウトマウスでは造血幹細胞の発生する9.5日目にはすでに胎生致死であることが判明した。今後造血細胞特異的なE11のノックアウトマウスを作成して造血幹細胞における機能を詳細にする。また、幹細胞、血管内皮細胞の接着に関わると考えられる分子の候補としてgalectin-3を単離した。今後galectin-3をTDB2遺伝子のプロモーター制御下で過剰発現するマウスを作成し、造血幹細胞性に与える影響を観察する。For regeneration therapy using hematopoietic stem cells(HSCs), it is necessary to expand HSCs in vitro effectively. We tried to analyze the self-renewal and maintenance of immature phenotype so called, "HSC\u27s stemness" for in vitro expansion of HSCs. In this experiment, we focused on receptor tyrosine kinase, TIE2,which is expressed on both HSCs and endothelial cells(ECs).We found that proliferation of HSCs are observed near ECs forming capillary in hematopoietic organ, such as fetal liver, bone marrow and so on and such HSCs produce angiopoietin-1(Ang1), a ligand for TIE2. Then, we analyzed the function of TIE2 for sternness by using constitutively active form of TIE2. Result showed that TIE2 activation promote several kinds of biological phenomena such as anti-apoptosis, delay of cell cycle, and enhancement of cell adhesion to matrix. Moreover, upon an activation of TIE2 on ECs and hematopoietic cells(HCs), those cells selectively adhered with each other tightly. This suggests that Ang1 from HSCs stimulates TIE2 on both HSCs and ECs in the foci and becomes trigger for cell adhesion and stemness of HSCs.Based on these experiments, we tried to isolate TIE2 activation associating gene using micro-array methods and obtained several candidate genes. E11, a novel gene of putative transcriptional factor, expresses on several stem cells in variety of organ and targeted disruption of this gene led to early embryonic lethality before HSCs develop. We will try to establish knock out mice those have HSCs specifically disrupted of E11 gene and analyze this gene in hematopoiesis precisely. Moreover, we isolated a candidate gene, galectin-3, that may associate with cell adhesion between HSCs and ECs. We have started to generate a transgenic mice expressing galectin-3 on HSCs and ECs under the transcriptional control of TIE2 promoter and will analyze the stemness of HSCs using this mice.研究課題/領域番号:13470207, 研究期間(年度):2001 – 2003出典：「造血幹細胞の発生・自己複製に関わる分子クローニングとその機能解析」研究成果報告書　課題番号13470207（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-13470207/134702072003kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作