Mobilité cellulaire induite par les chimères Ber-Abl (un nouveau modèle pour l'exploration des voies effectrices des petites protéines G de la famille Rho)

Les chimères Bcr-Abl sont dues à une translocation réciproque entre les chromosomes 9 et 22, entrainant la fusion des gènes bcr et abl. La seule différence structurale entre p190bcr abl, associé avec la Leucémie Aigue Lymphoblastique, et p210bcr-abl, responsable de la Leucémie Myéloïde Chronique, réside dans le domaine DH/PH présent uniquement dans p210bcr-abl. Nous avons montré précédemment que Rac1 était activée dans les cellules exprimant p190bcr-abl et p210bcr-abl alors que RhoA n est activé que dans les cellules exprimant p210bcr-abl (Harnois et al., Oncogene, 2003). Les cellules Ba/F3 parentales ne sont pas spontanément mobiles contrairement aux cellules Ba/F3p210 and Ba/F3p190. Les cellules exprimant p210bcr-abl présentent des mouvements amoeboïdes typiques alors que les cellules exprimant p190bcr-abl utilisent une mobilité de type roulement (rolling-type). Les résultats obtenus en utilisant des mutants des domaines GEF de Vav ou p210bcr-abl nous ont permis de proposer un modèle dans lequel Vav, en complexe avec Bcr-Abl, est responsable à travers l activation de Rac1 du déclenchement de la motilité des cellules exprimant Bcr-Abl. Le GEF de p210bcr-abl, spécifique de l activation de RhoA, est indispensable pour la formation des mouvements amoeboïdes dans les cellules Ba/F3, mais ne joue pas de rôle dans le déclenchement de la mobilité spontanée de ces cellules (Daubon et al., Oncogene, 2008). Nous avons ensuite caractérisé une voie passant par Rac1/PAK1/LIMK1/cofiline1 dans laquelle chaque élément est essentiel pour le déclenchement de la motilité dite rolling-type. Nous avons montré que la voie classique RhoA/ROCK/MLC était seulement partiellement impliquée dans l induction de la motilité amoeboïde dans les cellules Ba/F3p210. De façon surprenante, nous avons trouvé que RhoA et ROCK1 induisent l activation de l isoforme ADF/destrine de la famille des Actin Depolymerizing Factors , à travers la régulation négative de la LIMK2 au niveau transcriptionnel mais aussi par une dégradation protéasome-dépendante. Cette voie de signalisation originale permet une meilleure caractérisation des mécanismes moléculaires menant aux mouvements amoeboïdes en 3 dimensions.Bcr-Abl chimeras are produced by a reciprocal t(9;22) chromosomal translocation that fuses varying amounts of the bcr with the abl genes. The only structural difference between p190bcr-abl, associated with acute lymphoid leukaemia, and p210bcr-abl, responsible for chronic myelogenous leukaemia, resides in a DH/PH domain only present in p210bcr-abl. We previously showed that Rac1 was activated in both p190bcr-abl- and p210bcr-abl-expressing cells whereas RhoA was activated in p210bcr-abl-expressing cells only (Harnois et al., Oncogene, 2003). Ba/F3 cells were not spontaneously motile in 3D matrigel while Ba/F3p210 and Ba/F3p190 cells moved spontaneously. p210bcr-abl-expressing cells presented typical amoeboid movements in contrast to 190bcr-abl-expressing cells, which showed a rolling-type mobility. The results obtained using mutated GEF domain of Vav or p210bcr-abl allowed to propose a model in which Vav, in complex with Bcr-Abl, is responsible through Rac1 activation for triggering the motility of Bcr-Abl expressing cells. The GEF of p210bcr-abl specific of RhoA does not trigger motility by itself, but RhoA activation is crucial for committing leukaemic cells to amoeboid movements (Daubon et al., Oncogene, 2008). Bcr-Abl-expressing cells represent then a powerful model to explore the still un-understood amoeboid motility. Then, we characterized a Rac1/PAK1/LIMK1/Cofilin pathway in which each element is critical for triggering the rolling-type motility. We also showed that the classical RhoA/ROCK/MLC pathway was only partially involved in the amoeboid motility of the Ba/F3p210 cells. Surprisingly, we found that RhoA and ROCK1 induced the activation of the ADF/destrin isoform of the Actin Depolymerizing Factor family, through the specific down-regulation of LIMK2 both at the transcriptional level and by proteasome-dependent degradation. This original pathway drives to characteristic amoeboid movements. Taken together, these results on the Ba/F3 cells motility improve the understanding of the molecular mechanisms leading to these 3 dimensional motility modes.POITIERS-BU Sciences (861942102) / SudocSudocFranceF

Coopération entre Bcr-Abl et p95vav pour l'induction de la mobilité cellulaire médiée par les GTPases de la famille Rho

La protéine chimère Bcr-Abl résulte de la translocation chromosomique réciproque t(9 ;22). Cette protéine existe sous deux formes principales : p190bcr-abl, responsable de la Leucémie Aiguë Lymphoblastique, et p210bcr-abl, responsable de la Leucémie Myéloïde Chronique. La seule différence structurale entre ces deux formes est la présence chez p210bcr-abl du domaine DH (Dbl Homology) de Bcr, porteur d'une activité d'échange pour les petites protéines G de la famille Rho. De plus, la protéine p95vav, présentant également un domaine DH, est complexée sous forme activée aux deux formes de Bcr-Abl. Bcr-Abl intervient dans de nombreuses voies de signalisation comme l'inhibition de l'apoptose, la prolifération ou la réorganisation du cytosquelette d'actine. Le travail présenté dans ce mémoire a permis de démontrer que dans l'activation des GTPases de la famille Rho induite par Bcr-Abl, Vav est responsable de l'activation de Rac1 et Bcr-Abl de RhoA. L'activation de Cdc42, induite en partie par Vav, passe certainement par une autre protéine à activité facteur d'échange qui reste à identifier. De plus, nos résultats suggèrent l'existence d'une synergie entre les domaines DH des protéines GEF, facilitant l'activation des GTPases. Enfin, nous avons pu démontrer que l'activité facteur d'échange de Vav n'est pas indispensable au pouvoir transformant de Bcr-Abl et qu'un autre domaine de Vav y participe. Au niveau de la mobilité cellulaire induite par Bcr-Abl, nous avons montré que les mouvements amoeboïdes sont liés à l'activation de RhoA, ce qui contredit certaines données de la littérature. Enfin, nous avons mis en évidence une nouvelle voie d'activation de Rac1 impliquant la protéine Vav2 et la GTPase RhoG. Ces éléments nous ont permis de faire évoluer le modèle d'activation différentielle des petites protéines G de la famille Rho dans le cadre des leucémies et nous avons proposé ce modèle, centré sur l'activation différentielle de RhoA, pour le suivi moléculaire des patients.The chimerical oncogene BCR-ABL is known to induce autonomous motility of leukemic cells. We previously showed that p210bcr-abl responsible for chronic myelogenous leukaemia activates RhoA and Rac1, while p190bcr-abl, associated with acute lymphoid leukaemia, although devoid of a DH domain activates Rac1, but not RhoA. Moreover p95vav is present in an activated state in complex with Bcr-Abl. Here, we investigated the regulation of GEF activities in the BCR-ABL complex. For that purpose, different GEF activity mutants of Vav and of BCR-ABL were constructed and stably transfected in Ba/F3 cells. We demonstrated that RhoA is exclusively activated by the DH domain of p210bcr-abl, while Rac1 activation was only due to Vav. We show that p210bcr-abl induces a specific amoeboid mobility which is due to RhoA activity, while p190bcr-abl induces a rolling type mobility associated with Rac1 activity. Finally, our results reveal a synergistic mechanism between BCR-ABL and Vav GEFs. Moreover, we demonstrated the presence of Vav2 and GTPase RhoG in the complex with Bcr-Abl. This new signaling pathway cooperates with Vav to activate Rac1 and probably Cdc42. Recently, using blood patient samples, we proved that our model of differential activation of Rho GTPases in leukemia disease is valid. We proposed a molecular study to follow up the leukemia diseases of patients.POITIERS-BU Sciences (861942102) / SudocSudocFranceF

Interaction et activation différentielles des petites protéines G de la famille rho par p210bcr-abl et p190bcr-abl

Le chromosome Philadelphie associé à certaines leucémies résulte d'une translocation chromosomique réciproque t (9 ; 22) mettant en phase les gènes Bcr et Abl. Selon le point de cassure dans le gène Bcr, différentes protéines chimériques sont produites, p210bcr-abl responsable de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) et p190bcr-abl responsable de la Leucémie Aigüe Lymphoblastique (LAL). La seule différence entre les deux formes de Bcr-Abl est l'absence du domaine DH de Bcr dans la forme p190. Il s'agit d'un domaine d'homologie avec le domaine Dbl, un facteur d'échange pour les GTPases de la famille Rho. Nous avons pu montrer que la chimère p210bcr-abl est capable de lier et d'activer les trois GTPases RhoA, Rac1 et Cdc42. La chimère p190bcr-abl, malgré l'absence du domaine GEF, est capable d'activer Rac1 et Cdc42. Cette activité facteur d'échange observée pour p190bcr-abl semble provenir de partenaires associés à la fois à p210bcr-abl et à p190bcr-abl comme la protéine Vav possédant une activité facteur d'échange pour Rac1 et Cdc42. En revanche, p210bcr-abl est capable par son domaine GEF d'activer directement la petite protéine G RhoA. Ces résultats nous ont permis de mettre en place un modèle hypothétique de régulation de l'activité de ces GTPases par Bcr-Abl au sein des deux pathologies.The Philadelphia chromosome associated with several leukaemia results a reciprocal translocation between the Abl gene on chromosome 9 and the Bcr gene on chromosome 22. Depending on locations of the breakpoint on the BCR genome, there are two alternative forms of BCR-ABL: p210bcr-abl, found in chronic myelogenous leukemia (CML), and p190bcr-abl, found in acute lymphocytic leukemia (ALL). The only difference between both forms of Bcr-Abl is the absence of the DH domain of Bcr in the form p190bcr-abl. The present work showed interactions and activation of Rho family GTPases by Bcr-Abl thanks to techniques of coimmunoprecipitation, pull-down, GEF activity and confocal microscopy. We can demonstrate that p210bcr-abl interacts and activates RhoA, Rac1 and Cdc42. In spite of the lack of a GEF domain, the p190bcr-abl is able to activate Rac1 and Cdc42. This GEF activity from p190bcr-abl seems to come from partners associated like Vav protein having an GEF activity from Rac1 and Cdc42. We showed the Vav protein presence in complex in the form activated with Bcr-Abl. In contrast, p210bcr-abl is able to activate directly RhoA by the GEF domain of Bcr. These results allowed to set up a model of development of leukaemia Philadelphia chromosome, in which Rac1 and Cdc42 activated by p190bcr-abl and p210bcr-abl are implicated in the cellular transformation (in inhibition of apoptosis, cell motility and proliferation). Whereas the specific activation of RhoA by p210bcr-abl regulated the myeloid cell differentiation, that is the characteristic during the chronic phase of the CML.POITIERS-BU Sciences (861942102) / SudocSudocFranceF

Rôle des GTPases de la famille Rho dans la résistance à l'apoptose induite par Bcr-Abl

Certaines leucémies sont associées au chromosome Philadelphie. Il résulte d'une translocation chromosomique qui entraîne la production d'une protéine chimérique Bcr-Abl de 210 kD ou 190 kD. La seule différence entre les deux formes de Bcr-Abl est l'absence du domaine DH de Bcr (domaine d'homologie avec le domaine Dbl, un facteur d'échange pour les GTPases de la famille Rho) dans la forme p190. Alors que la protéine Abl est une tyrosine kinase finement régulée, l'activité tyrosine kinase d'Abl devient constitutive dans Bcr-Abl et cette protéine est délocalisée. Par ailleurs, Bcr-Abl active la prolifération et inhibe l'apoptose des cellules qui l'expriment. Des interactions entre les GTPases de la famille Rho et Bcr-Abl ont été récemment mises en évidence au laboratoire. Notre objectif était d'étudier le rôle potentiel des GTPases de la famille Rho dans la résistance à l'apoptose induite par Bcr-Abl. Nous avons tout d'abord montré le rôle de RhoA dans plusieurs voies de signalisation dans des cellules adhérentes. Nous avons ensuite comparé la sensibilité d'une lignée murine de type lymphocytaire exprimant ou non Bcr-Abl à l'apoptose et étudié la régulation des voies apoptotiques. En particulier, nous avons montré que le LY294002, inhibiteur de la PI-3 K n'avait pas d'action sur les cellules exprimant Bcr-Abl. En revanche, le STI-571, un inhibiteur sélectif de l'activité tyrosine kinase d'Abl agit spécifiquement sur ces cellules. Enfin, l'association de ces deux agents induit une potentialisation de l'effet du STI-571 sur les cellules exprimant Bcr-Abl. Enfin, nous avons établi et caractérisé des lignées cellulaires exprimant simultanément Bcr-Abl et l'une des formes des GTPases de la famille Rho et nous avons étudié les modifications induites par ces GTPases sur l'apoptose. Nous avons ainsi montré que le blocage de Rac1 ou de Cdc42 sous forme dominante positive ou négative induisait une inhibition variable de l'apoptose des cellules exprimant Bcr-Abl.Several leukaemia result from a chromosomal translocation, which produces a chimeric Bcr-Abl protein of either 210 kD or 190 kD. The only difference between both forms of Bcr-Abl is the absence of the DH domain of Bcr in p190. Bcr-Abl has a constitutive tyrosine kinase activity and is delocalised. It activates proliferation and inhibits apoptosis. The aim of this work was to study the role of Rho family GTPases in the resistance to apoptosis induced by Bcr-Abl. We showed the role of RhoA in several signalling pathways in adherent cells. Then we compared the sensitivity to apoptosis of murine B prolymphocytes, expressing or not Bcr-Abl, and studied regulation of apoptotic pathways. At last, we established and characterised cell lines co-expressing Bcr-Abl and Rho family GTPases and we studied modifications induced by theses GTPases on apoptosis.POITIERS-BU Sciences (861942102) / SudocSudocFranceF

Rho GTPases in kidney physiology and diseases

International audienceRho family GTPases are molecular switches best known for their pivotal role in dynamic regulation of the actin cytoskeleton, but also of cellular morphology, motility, adhesion and proliferation. The prototypic members of this family (RhoA, Rac1 and Cdc42) also contribute to the normal kidney function and play important roles in the structure and function of various kidney cells including tubular epithelial cells, mesangial cells and podocytes. The kidney’s vital filtration function depends on the structural integrity of the glomerulus, the proximal portion of the nephron. Within the glomerulus, the architecturally actin-based cytoskeleton podocyte forms the final cellular barrier to filtration. The glomerulus appears as a highly dynamic signalling hub that is capable of integrating intracellular cues from its individual structural components. Dynamic regulation of the podocyte cytoskeleton is required for efficient barrier function of the kidney. As master regulators of actin cytoskeletal dynamics, Rho GTPases are therefore of critical importance for sustained kidney barrier function. Dysregulated activities of the Rho GTPases and of their effectors are implicated in the pathogenesis of both hereditary and idiopathic forms of kidney diseases. Diabetic nephropathy is a progressive kidney disease that is caused by injury to kidney glomeruli. High glucose activates RhoA/Rho-kinase in mesangial cells, leading to excessive extracellular matrix production (glomerulosclerosis). This RhoA/Rho-kinase pathway also seems involved in the post-transplant hypertension frequently observed during treatment with calcineurin inhibitors, whereas Rac1 activation was observed in post-transplant ischaemic acute kidney injury

Les myélinosomes : une nouvelle voie du contrôle de qualité des protéines

International audienceMaintenance of cell proteostasis relies on two degradation pathways: proteasome and autophagy. Here we describe a new proteostasis pathway avoiding degradation of abnormal proteins yet carrying them outside the cell using nanovesicles called myelinosomes. These myelinosomes are produced in pathological or stress situations in relation with genetic or environmental factors. Myelinosome vesicles are nano-sized multi-stacked membrane structures, resembling myelin sheath. It has recently been shown in two models of genetic diseases (Huntington's disease and cystic fibrosis) that myelinosomes are important for eliminating mutant proteins in an unusual secretory process, thus preventing their accumulation and aggregation in cells

MERTK-Mediated LC3-Associated Phagocytosis (LAP) of Apoptotic Substrates in Blood-Separated Tissues: Retina, Testis, Ovarian Follicles

International audienceTimely and efficient elimination of apoptotic substrates, continuously produced during one's lifespan, is a vital need for all tissues of the body. This task is achieved by cells endowed with phagocytic activity. In blood-separated tissues such as the retina, the testis and the ovaries, the resident cells of epithelial origin as retinal pigmented epithelial cells (RPE), testis Sertoli cells and ovarian granulosa cells (GC) provide phagocytic cleaning of apoptotic cells and cell membranes. Disruption of this process leads to functional ablation as blindness in the retina and compromised fertility in males and females. To ensure the efficient elimination of apoptotic substrates, RPE, Sertoli cells and GC combine various mechanisms allowing maintenance of tissue homeostasis and avoiding acute inflammation, tissue disorganization and functional ablation. In tight cooperation with other phagocytosis receptors, MERTK-a member of the TAM family of receptor tyrosine kinases (RTK)-plays a pivotal role in apoptotic substrate cleaning from the retina, the testis and the ovaries through unconventional autophagy-assisted phagocytosis process LAP (LC3-associated phagocytosis). In this review, we focus on the interplay between TAM RTKs, autophagy-related proteins, LAP, and Toll-like receptors (TLR), as well as the regulatory mechanisms allowing these components to sustain tissue homeostasis and prevent functional ablation of the retina, the testis and the ovaries

Analysis of a Mathematical Model for the Glutamate/Glutamine Cycle in the Brain

International audienceOur aim in this article is to study the well-posedness and properties of a system with delay which is related with brain glutamate and glutamine kinetics. In particular, we prove the existence and uniqueness of nonnegative solutions. We also give numerical simulations and compare their order of magnitude with experimental data

Nav1.5 channels can reach the plasma membrane through distinct N-glycosylation states.

articleInternational audienceLike many voltage-gated sodium channels, the cardiac isoform Nav1.5 is well known as a glycoprotein which necessarily undergoes N-glycosylation processing during its transit to the plasma membrane. In some cardiac disorders, especially the Brugada syndrome (BrS), mutations in Nav1.5 encoding gene lead to intracellular retention and consequently trafficking defect of these proteins. We used two BrS mutants as tools to clarify both Nav1.5 glycosylation states and associated secretory behaviors. Patch-clamp recordings and surface biotinylation assays of HEK293T cells expressing wild-type (WT) and/or mutant Nav1.5 proteins were performed to assess the impact of mutant co-expression on the membrane activity and localization of WT channels. Enzymatic deglycosylation assays and brefeldin A (BFA) treatments were also employed to further characterize recombinant and native Nav1.5 maturation. The present data demonstrate that Nav1.5 channels mainly exist as two differentially glycosylated forms. We reveal that dominant negative effects induced by BrS mutants upon WT channel current result from the abnormal surface expression of the fully-glycosylated forms exclusively. Furthermore, we show that core-glycosylated channels can be found at the surface membrane of BFA-treated or untreated cells, but obviously without generating any sodium current. Our findings provide evidence that native and recombinant Nav1.5 subunits are expressed as two distinct matured forms. Fully-glycosylated state of Nav1.5 seems to determine its functionality whereas core-glycosylated forms might be transported to the plasma membrane through an unconventional Golgi-independent secretory route. This work highlights that N-linked glycosylation processing would be critical for Nav1.5 membrane trafficking and function

Molecular biology : methods and exercises

Cet ouvrage constitue une méthode progressive et efficace pour comprendre et appliquer les concepts fondamentaux de la biologie moléculaire. Il propose : des rappels de cours sous forme de fiches, des exercices pour s'évaluer (QCM, questions Vrai/Faux, exercices de synthèse...), des corrigés détaillés. Des exercices d’entraînement supplémentaires sont téléchargeables sur le site dunod.com