Herstellung und Charakterisierung mesenchymaler Stammzellen bei Patienten nach allogener Blutstammzelltransplantation

Mesenchymale Stammzellen sind bindegewebige Vorläuferzellen, die sich als Bestandteile des adulten Knochenmarkstromas aus dem Knochenmark isolieren und unter geeigneten Kulturbedingungen ex vivo expandieren lassen. Die Zellen sind in der Lage, sich durch Teilung selbst zu erhalten und verschiedenartig differenzierte Tochterzellen hervorzubringen, so zum Beispiel Osteozyten, Chondrozyten, Myozyten, Fibrozyten und Adipozyten. Die Frage, ob mesenchymale Stammzellen im Rahmen einer allogenen Blutstammzelltransplantation mit übertragen werden, konnte bisher nicht zufriedenstellend beantwortet werden. Ebenso ist im Falle einer Über-tragung das Schicksal der Spenderzellen im Empfängerorganismus unklar. In der vorliegenden Arbeit sollte zunächst ergründet werden, ob mesenchymale Stammzellen im Rahmen einer allogenen peripheren Blutstammzelltransplantation mit übertragen werden. Dazu wurden Leukapheresate von Spendern nach peripherer Blutstammzelltransplantation im Vergleich zu Knochenmark von Spendern nach Knochenmarktransplantation untersucht. Desweiteren sollten bei Empfängern allogener peripherer Blutstammzelltransplantationen und allogener Knochenmark-transplantationen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transplantation mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark isoliert werden, um bei diesen den vom Blutstammzellspender stammenden Mengenanteil zu ermitteln. Um mesenchymale Stammzellen aus Leukapheresaten zu isolieren, erfolgte zuerst eine Dichtegradientenzentrifugation, der sich entweder die unmittelbare Zellkultur oder die Kultivierung nach weiterer Auftrennung durch magnetische Zellsortierung anschloss. Zur Isolation der mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark wurden Knochenmarkaspirate von Empfängern nach Blutstammzelltransplantation zunächst ebenfalls mittels Dichtegradientenzentrifugation aufgetrennt und im Anschluss die daraus gewonnene mononukleäre Zellfraktion kultiviert, wobei die mesenchymalen Stammzellen durch die Wahl der Kulturbedingungen selektioniert und expandiert wurden. Aus den Zellen wurde dann die genomische DNS extrahiert und durch Mikrosatellitenanalyse der Spenderzellanteil ermittelt. Es wurden Leukapheresate von neun Spendern sowie Knochenmark von zwei Spendern nach Transplantation bearbeitet. Aus den Leukapheresaten konnten mit den verwendeten Methoden keine mesenchymalen Stammzellen isoliert und angezüchtet werden. Dagegen gelang dies aus dem Knochenmark problemlos. Bei den Empfängern allogener Blutstammzelltransplantationen wurden Knochenmark-aspirate von 34 Patienten aufgearbeitet, wobei die Anzucht der mesenchymalen Stammmzellen bei Aspiraten von 27 Patienten, die zwischen 25 und 1334 Tagen nach Transplantation gewonnen wurden, erfolgreich war. Von den 27 Proben stammen 18 von Empfängern nach peripherer Blutstammzelltransplantation und neun von Empfängern nach Knochenmarktransplantation. Bei vier der Patienten nach peripherer Blutstammzelltransplantation war durch Mehrfachanalysen die Darstellung eines intraindividuellen Verlaufs möglich. Die Mikrosatellitenanalyse ergab in fast allen untersuchten Fällen einen Spenderanteil von null Prozent. Lediglich in zwei Proben nach peripherer Blutstammzelltransplantation wurden schwache Spendersignale detektiert, deren Anteil aber unter fünf Prozent betrug. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit verdeutlichen, dass mesenchymale Stammzellen bei der allogenen Knochenmarktransplantation mit übertragen werden, während im Rahmen der allogenen peripheren Blutstammzelltransplantation ihre Übertragung nicht gezeigt werden konnte. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach allogener Blutstammzelltransplantation waren weder im Falle der Knochenmark-transplantation noch bei der peripheren Blutstammzelltransplantation mesenchymale Stammzellen des Spenders im Knochenmark des Empfängers nachweisbar, während die Blutzellen zum jeweils gleichen Zeitpunkt ein Spenderprofil aufwiesen. Die klinische Bedeutsamkeit der mesenchymalen Stammzellen des Spenders im Rahmen einer Blutstammzelltransplantation ist vor dem Hintergrund der Ergebnisse fraglich. Die Zellen, die während einer Knochenmarktransplantation mit übertragen werden, könnten immunologisch bedeutungsvoll sein, so beispielsweise im Zusammenhang mit dem im Vergleich zur peripheren Blutstammzelltransplantation verminderten Auftreten der Graft-versus-Host-Disease

Regulationsmechanismen des Interferon regulatorischen Faktors IRF-4 in der chronisch myeloischen Leukämie

Zahlreiche Untersuchungen weisen darauf hin, dass die Gruppe der Interferon-regulatorischen Faktoren (IRF), darunter insbesondere ICSBP und IRF-4, in der Pathogenese der CML eine wichtige Rolle spielt. In peripherem Blut von Patienten mit CML in der chronischen Phase ist die IRF-4-Expression im Vergleich zu Normalblut signifikant herunterreguliert. Eine Therapie mit Interferon-α vermag das IRF-4-Level der Patienten wieder anzuheben und zwischen gutem Ansprechen und hohem IRF-4-Level besteht eine positive Korrelation. Diese Daten könnten auf eine mögliche antileukämische Wirkungsweise von IRF-4 bei Erkrankungen des myeloiden Systems hinweisen. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der deregulierten IRF-4-Expression in Leukämiezellen untersucht. Die IRF-4-Promotor-Region von hämatopoetischen Zellinien, CML-Patienten und normalen Spendern als Kontrolle wurde dabei auf genetische und epigenetische Veränderungen untersucht. Um genetische Aberrationen auszuschließen, wurde der IRF-4-Promotor sequenziert. Dabei wurden keine genetischen Läsionen gefunden, die für die inhibierte IRF-4-Transkription verantwortlich sein könnten. Die detektierten Variationen an Position -1081 (T→C-Substitution), an Position -1068 (A→C-Substitution) und Position -116 (T→C-Substitution) finden sich sowohl in IRF-4-positiven als auch in IRF-4-negativen Zelllinien; die letztgenannte Substitution taucht zudem auch bei CML-Patienten in chronischer Phase und in Normalblut von Kontrollpersonen auf. Diese Basenpaarvariationen sind folglich sehr wahrscheinlich nicht die Ursache für die Expressionsunterschiede und stellen eher Polymorphismen dar. Keine der beschriebenen Sequenzänderungen betrifft eine bekannte Transkriptionsfaktorbindungsstelle. Die bei CML-Patienten in vivo nachgewiesene Induzierbarkeit der IRF-4-Expression macht reversible Inhibitionsmechanismen ohnehin wahrscheinlicher. Deshalb wurde der IRF-4-Promotor auf aberrante Methylierung untersucht, welche bereits bei einem anderen IRF, IRF-7, nachgewiesen wurde. Um die Relevanz dieses epigenetischen Mechanismus für die IRF-4-Regulation zu untersuchen, wurden verschiedene Zellinien mit demethylierenden Substanzen behandelt. Die Inkubation mit 5-Aza-2-deoxycytidin zeigte eine konzentrations- und zeitabhängige Aktivierung der IRF-4-Expression, die auf mRNA- und Proteinebene nachgewiesen werden konnte. Um den Methylierungsstatus des IRF-4-Promotors zu bestimmen, wurden ein Restriktions-PCR-Assay sowie die Sequenzierung des Promotors nach Bisulfit-Behandlung durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die IRF-4-negativen Zellinien ein höheres Methylierungslevel aufwiesen als die IRF-4-positiven Zellen und dass die IRF-4-Expression zudem mit dem Methylierungsstatus spezifischer CpGs im Promotor korreliert. Von besonderem Interesse ist dabei die Hypermethylierung einer NFκB-Bindungsstelle in IRF-4-negativen Zellinien. Die Bindung von c-Rel an NFκB-Elemente des Promotors spielt eine wichtige Rolle in der Induktion von IRF-4 und die Methylierung dieses Elements blockiert die Bindung des Transkriptionsfaktors. Ein im Anschluss an diese Arbeit durchgeführter Reporter-Gen-Assay konnte schließlich den inhibierenden Effekt von Methylierung auf den IRF-4-Promotor bestätigen. Die Bisulfit-Sequenzierung von DNA aus peripherem Blut von drei Normalpersonen und drei CML-Patienten in chronischer Phase zeigte keine aberrante Methylierung. Möglicherweise wurden hier jedoch die malignen Zellen im Gesamtblut nicht ausreichend erfasst; hier muss sich die Sequenzierung von sortierten Zellen anschließen. Eine mögliche und bei verschiedenen malignen Erkrankungen nachgewiesene Ursache für aberrante Methylierung ist die Überexpression von DNA-Methyltransferasen (DNMT). Die Expressionsanalyse der DNMTs (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B) und Methyl-CpG-Bindungsproteine (MBP) (MBD1, MBD2, MBD4, MeCP) zeigte jedoch keine konsistenten Unterschiede zwischen IRF-4-positiven und –negativen Zellinien, so dass der Hypermethylierung wahrscheinlich andere Mechanismen zugrunde liegen. Zusammenfassend lassen die erhobenen Daten die Schlussfolgerung zu, dass IRF-4-Promotor-Methylierung die IRF-4-Expression reguliert und das die aberrante Expression von IRF-4 in verschiedenen Leukämietypen eine Konsequenz einer IRF-4-Promotor-Hypermethylierung sein könnte. Inwieweit dieser Mechanismus in vivo wirksam ist, muss, beispielsweise durch Analyse von Subpopulationen aus Patientenproben, noch bestimmt werden

Biologische Effekte eines CD82-spezifischen monoklonalen Antikörpers auf die normale und maligne Hämatopoese

Tetraspanine sind eine Gruppe transmembranärer Proteine mit charakteristischem Aufbau, die in variabler Expression auf nahezu allen humanen Zellen vorkommen. Ihre Funktionen sind sehr vielfältig, aber noch immer nicht abschließend geklärt. Eine Hauptfunktion der Tetraspanine ist jedoch die Regulation der Interaktion von Zellen durch eine Beeinflussung der Stabilität und Kooperation multimerer Proteinkomplexe auf der Zelloberfläche. Über ihre Rolle in der Hämatopoese ist bisher nur wenig bekannt. Das Tetraspanin CD82 ist bekannt für seinen inhibierenden Einfluss auf das Metastasierungsverhalten zahlreicher solider Tumoren. Zudem besitzt es die Fähigkeit zur Auslösung eines kostimulatorischen Signals bei der T-Zell-Aktivierung. Obwohl CD82 auf hämatopoetischen Progenitorzellen und leukämischen Zellen stark exprimiert wird, war dessen Funktion in der Hämatopoese bisher unklar. Ziel dieser Studie war es daher, Erkenntnisse über die mögliche Bedeutung dieser Expression von CD82 auf unreifen normalen und vergleichend auf malignen Progenitoren zu gewinnen. Da bislang kein natürlicher Ligand für CD82 bekannt ist, wurde hierzu ein Antikörpermodell verwendet. Ein CD82-spezifischer aktivierender monoklonaler Antikörper, 50F11, diente als Ersatzligand für das transmembranäre CD82-Molekül. In Vorarbeiten konnten mit Hilfe dieses Modells eine verstärkte Adhäsion sowie Morphologieveränderungen bei normalen hämatopoetischen Progenitorzellen ausgelöst werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass maligne Blasten im Vergleich zu normalen Progenitorzellen generell ein Defizit für die CD82-induzierten biologischen Effekte zu haben scheinen und dass normale Stammzellen distinkte Effekte nach CD82-Aktivierung zeigen. Zu nennen wären hier in erster Linie die CD82-induzierte Adhäsion und Morphologieveränderung wie auch CD82-ligationsspezifische Zelloberflächenregulationen, insbesondere des Integrins VLA-4. In leukämischen Zellen waren diese Effekte zum Teil hoch signifikant gestört. Durch cDNA-Array-Analysen wurde erstmals Hox-D3 als ein mögliches Zielmolekül der CD82-vermittelten Signaltransduktion identifiziert. Schließlich konnte erstmals gezeigt werden, dass CD82-Aktivierung mit dem hier genutzten Antikörpermodell zu einer signifikanten Negativregulation der LTC-IC-Frequenzen führt. Dies bedeutet, dass CD82 ein Regulator der frühesten in vitro zugängigen menschlichen Hämatopoese zu sein scheint. Zusammengefasst ist CD82 ein neues Antigen, das in die Regulation der Biologie von hämatopoetischen Stammzellen involviert und dessen Funktion in leukämischen Blasten eingeschränkt ist. Die vorliegenden Daten geben Anlass zur weiteren Untersuchung der Rolle von CD82 in der Hämatopoese

Einfluss einer gain-of-function-Mutation im Plcg2-Gen auf eine Helicobacter felis-induzierte gastrale MALT-Lymphom Entwicklung

Das Marginalzonen B-Zell-Lymphom vom MALT (mucosa-associated lymphoid tissue)-Typ des Magens ist eine Modellerkrankung für das Verständnis, wie eine bösartige Tumorerkrankung aus einer chronischen bakteriellen Helicobacter pylori-Infektion entstehen kann. Unsere Arbeitsgruppe war eine der Ersten die zeigen konnte, dass eine Eliminierung von H. pylori im frühen Stadium eines MALT-Lymphoms in vielen Fällen eine langanhaltende Remission bewirkt. Eine H. pylori-Eradikation stellt somit die Therapie erster Wahl im frühen Stadium eines gastralen MALT-Lymphoms dar. Neben Helicobacter-spezifischen Virulenzfaktoren spielen spezifische Wirtsmerkmale bei der Entwicklung von MALT-Lymphomen eine ganz entscheidende Rolle. So führen verschiedene Wirtsgen-Polymorphismen, die für die Immunantwort und Entzündungsreaktion einer H. pylori-Infektion verantwortlich sind, zu einer gesteigerten inflammatorischen Antwort und zu einer stärkeren Neigung, gastrale MALT-Lymphome zu entwickeln. Zudem konnte unsere eigene Arbeitsgruppe zeigen, dass das Gen Phospholipase C gamma 2 in gastralen MALT-Lymphomen, im Vergleich zur chronischen Entzündungsreaktion, überexprimiert ist. Vor diesem Hintergrund untersucht die vorliegende Arbeit, inwieweit Mäuse, die aufgrund einer gain-of-function-Mutation im Plcg2-Gen Symptome einer gesteigerten Entzündungsreaktion und Autoimmunerkrankungen zeigen, eine frühere und höhere Inzidenz aufweisen, H. felis-induzierte MALT-Lymphome zu entwickeln. Eine H. felis-Infektion in Mäusen ruft dabei ganz ähnliche Symptome hervor wie eine humane H. pylori-Infektion. Entgegen der Erwartung konnte gezeigt werden, dass heterozygote Plcg2Ali5/+ Mäuse, im Vergleich zu WT Mäusen, signifikant weniger gastrale MALT-Lymphome entwickeln. Dies wurde von einer Herunterregulation proinflammatorischer Gene und einer verringerten H. felis-spezifischen Antikörperantwort in Plcg2Ali5/+ Mäusen begleitet. Ein B-Zell-Defekt in Plcg2Ali5/+ Mäusen konnte durch in vitro Experimente ausgeschlossen werden. Die Untersuchung regulatorischer T-Zellen im Milzgewebe beider Genotypen zeigte, dass Plcg2Ali5/+ Mäuse eine signifikant höhere Anzahl immunsuppressiver CD73 exprimierender Tregs besitzen. Anhand dieses Ergebnisses lässt sich die in Plcg2Ali5/+ Mäusen verringerte Immunantwort gegenüber einer Helicobacter-Infektion erklären. In dieser Arbeit konnte somit erstmals gezeigt werden, dass die gain-of-function-Mutation im Plcg2-Gen vor einer Helicobacter-induzierten MALT-Lymphom Entwicklung schützt. Die Experimente und Auswertungen innerhalb dieser Arbeit lassen die Schlussfolgerung zu, dass die in Plcg2Ali5/+ Mäusen auftretende erhöhte Anzahl von Tregs möglicherweise für die geringere Entzündungsreaktion und folglich für die reduzierte Entstehung des Lymphoms verantwortlich ist

Novel imantib resistance mechanisms in chronic myloid leukemia

In my research, I found that the compensatory activation of PI3K/AKT/mTor signaling pathway contributes early imatinib resistance in LAMA cell models. We also found that the auto/paracrine of GM-CSF by imatinib resistant leukemic cells confers to potent imatinib and nilotinib resistance. These findings may serve as a novel strategy to overcome disease resistance to imatinib

Ras-induzierte Differenzierung nach Schädigung der DNA in Zellen der akuten myeloischen Leukämie

Ras-Proteine gehören zu einer Familie von Proto-Onkogenen, die für kleine GTPasen kodieren. Sie sind an vielen zellulären Prozessen wie Zellteilung, Apoptose und Differenzierung beteiligt. In 20-30% aller menschlichen Tumore weisen die RAS-Gene Punktmutationen auf, die das Protein in einen konstitutiv aktiven Zustand versetzen. Aus einer retrospektiven Studie von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (CALGB 8525) ist hervorgegangen, dass es eine Korrelation zwischen RAS-Status und Rezidivrate nach hochdosierter Cytarabin-Behandlung gibt. Patienten mit mutiertem RAS und Hochdosis-Cytarabin Behandlung, entwickelten signifikant weniger häufig Rezidive als Patienten mit wildtyp RAS oder Patienten, die mit Niedrigdosis-Cytarabin behandelt wurden. Somit geht aus der Studie hervor, dass die Expression eines Onkogens in Tumorzellen positive Auswirkungen auf die Behandlung mit Chemotherapeutika haben kann. Ausgehend von dieser Beobachtung sollte in dieser Arbeit der Effekt von onkogenem RAS in einem Zellsystem in vitro studiert und die molekularen Mechanismen aufgeklärt werden. Um onkogenes Ras in einem Zellsystem zu untersuchen, das als Model für akute myeloische Leukämie herangezogen werden kann, wurden hämatopoetische Zellen der Maus, die mit dem onkogenen Fusionsprotein MLL-ENL immortalisiert wurden, verwendet. Das Fusionsonkoprotein MLL-ENL kommt ausschließlich in Leukämien vor und die Zellen zeigen einen myeloischen Phänotyp. Diese Zellen wurden mit einem Kontrollvektor bzw. mit einem Vektor, der onkogenes RASV12 exprimiert, infiziert und auf die Behandlung mit Chemotherapeutika, insbesondere Cytarabin, untersucht. Die zytotoxische Wirkung von Cytarabin beruht darauf, dass die Substanz das Fortschreiten der Replikationsgabel behindert, woraufhin eine NASchadenssignalkaskade aktiviert wird, die nachfolgend Zellzyklusarrest oder Apoptose vermittelt. Cytarabin wirkt somit hauptsächlich auf Zellen, die sich in der Replikationsphase befinden. In Suspension wiesen die RAS-infizierten Zellen auf die Behandlung mit Cytarabin keinen Unterschied zu den Kontroll-Zellen hinsichtlich Zellzahl, Zellzyklus und Apoptose auf. Erfolgte die Kultivierung jedoch in semisolidem Medium, um die Klonogenität der Zellen zu untersuchen, zeigten die RAS-infizierten Zellen nach der Behandlung mit Cytarabin, Etoposid und Daunorubicin, eine starke Einschränkung in der Koloniebildung. Um die Ursache festzustellen, wodurch die klonogenen Zellen eliminiert werden, wurden die Zellen hinsichtlich Apoptose, Seneszenz und Differenzierung untersucht. Expressions- und Durchflusszytometrie-Analysen von Apoptosemarkern belegen, dass die Induktion von Apoptose in den RAS-infizierten Zellen niedriger war als in den Kontroll-Zellen und Apoptose damit nicht als Ursache für die eingeschränkte Klonogenität herangezogen werden kann. Aus der Literatur ist bekannt, dass die Infektion von primären Zellen mit onkogenem Ras eine DNA-Schadensantwort aktiviert, die einen seneszenten Phänotyp auslöst. Seneszente Zellen zeichnen sich durch eine erhöhte Expression von p53, p21Cip1 und des Ink4/Arf Locus (mit den Tumor Suppressoren p16Ink4a, p19Arf und p15Ink4b) aus. Zudem exprimieren seneszente Zellen das Enzym SA-β-Galaktosidase, dessen Aktivität in den Zellen sichtbar gemacht werden kann. Die Untersuchung der Kontrollproteine Chk1, H2A.x und ATM ergab, dass die DNASchadensantwort nur in den RAS-infizierten Zellen aktiviert war und diese durch Cytarabin weiter verstärkt wurde. Die Proteine p53, p21Cip1, p16Ink4a, p19Arf und p15Ink4b wurden in den RAS-infizierten Zellen stärker exprimiert als in den Kontroll-Zellen und durch Cytarabin teilweise weiter induziert (p53 und p21Cip1). Dagegen wurde das Enzym SA-β-Galaktosidase, sowohl in Kontroll-Zellen als auch in RAS-infizierten Zellen durch die Behandlung mit Cytarabin gleichermaßen aktiviert, was einen Hinweis darauf gibt, dass Cytarabin in Kontroll-Zellen Seneszenz auslösen kann. Die oben genannten Proteine sind auch in differenzierten Zellen stärker exprimiert. Ferner löst onkogenes Ras in hämatopoetischen Zellen Differenzierung aus, was im Übrigen auch für Cytarabin gezeigt wurde. Expressions- und Durchflusszytometrie-Analysen der Differenzierungsmarker ly6g (Gr1) und itgam (Mac1) zeigen, dass RAS-infizierte Zellen stärker differenziert waren als Kontroll-Zellen und die Behandlung mit Cytarabin die Differenzierung weiter verstärkte. Dies wurde auch anhand der Morphologie der Zellen bestätigt. Entscheidend für die Induktion der Differenzierung war dabei die Aktivierung der DNASchadenssignalkaskade, was durch die zusätzliche Behandlung der Zellen mit dem ATM/R-Inhibitor Koffein belegt werden konnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass konventionelle Zytostatika einen weiteren Mechanismus zur Tumorbekämpfung aktivieren können: Differenzierung. Differenzierung als therapeutischer Ansatz findet bereits in der Behandlung der akuten Promyelozyten Leukämie Anwendung. Die Induktion der Differenzierung könnte vor allem für Tumor-initiierende Zellen von größtem Interesse sein. Diese Krebsstammzellen werden durch herkömmliche Chemotherapeutika oft nicht vollständig eliminiert und können somit Ursache für Rezidive sein. Die Entwicklung von Substanzen, die die Differenzierung dieser Zellen aktivieren, wäre ein wichtiger Schritt der Resistenz vieler Tumorzellen gegenüber Chemotherapeutika entgegenzuwirken

IL-4 Rezeptor α Polymorphismen und IL-4 sowie IFN-γ mRNA-Expression in MALT-Lymphomen des Magens

Die Lymphome des mukosaassoziierten lymphatischen Gewebes (Lymphome vom MALT-Typ) entwickeln sich aus sekundärem lymphatischen Gewebe. Im Magen entsteht dieses sekundäre MALT als Folge einer chronischen Infektion mit Helicobacter pylori. Die MALT-Lymphome des Magens machen etwa 8 % aller Non-Hodgkin-Lymphome aus. MALT-Lymphompatienten sind in mehr als 90 % der Fälle mit H. pylori infiziert und mittels Eradikation von H. pylori kann in vielen Fällen eine Regression des Lymphoms erreicht werden. Nichtneoplastische tumorinfiltrierende CD4 positive T-Lymphozyten (T-Helferzellen, TH-Zellen) reagieren spezifisch mit dem infizierenden H. pylori-Stamm und unterstützen in der Folge die Proliferation der B-Zellen des MALT-Lymphoms. Auf der Grundlage von Zellkulturversuchen und Zytokinexpressionsuntersuchungen wurde vermutet, dass die Hilfe der tumorinfiltrierenden TH-Zellen für die MALT-Lymphomzellen über die Sekretion von TH2-Zytokinen erfolgt. TH-Zellen können nach ihrem Zytokinproduktionsprofil in TH1- und TH2-Zellen differenziert werden; als Markerinterleukine gelten Interferon-γ (IFN-γ) für TH1-Zellen bzw. Interleukin-4 (IL-4) für TH2-Zellen. TH1- und TH2-Zellen können als polarisierte Formen der spezifischen Immunantwort angesehen werden; die deutlichsten Ausprägungen der TH1/TH2-Dichotomie finden sich in chronischen Erkrankungsstadien. Die Erkrankungen des atopischen Formenkreises, insbesondere das Asthma bronchiale, wurden als sicher TH2-vermittelt erkannt. Viele Untersuchungen konnten eine Assoziation zwischen dem Asthma bronchiale und Polymorphismen im IL-4 Rezeptor α (IL-4Rα) nachweisen. Aufgrund dieser Assoziation und der Tatsache, dass IL-4 seine Wirkung (u.a. die TH2-Zellantwort induzierende) über den IL-4Rα entfaltet, sowie Hinweisen auf eine gesteigerte Signaltransduktion über den Rezeptor bei Vorliegen von IL-4Rα Polymorphismen, wurde postuliert, dass sich (einzelne) IL-4Rα Polymorphismen begünstigend auf die Entwicklung einer TH2-Zellantwort auswirken könnten. Unter der Annahme, dass die Entwicklung von MALT-Lymphomen mit einer lokalen TH2-Zellantwort einhergeht und in Anbetracht der Assoziation einzelner IL-4Rα Polymorphismen mit TH2-vermittelten Erkrankungen, wurden 99 MALT-Lymphompatienten und 120 Kontrollpersonen mittels einer allelspezifischen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf das Vorliegen der sieben bekannten IL-4Rα Polymorphismen untersucht. Bisher liegen nur wenige Daten zur Expression von Interleukinprofilen in MALT-Lymphomen vor. Deshalb wurde die mRNA Expression von IFN-γ in je 15 und von IL-4 in je sieben MALT-Lymphomen und H. pylori-Gastritiden mittels einer quantitativen Real-Time-PCR untersucht. Die Validierung der Ergebnisse der allelspezifischen PCR erfolgte mittels Sequenzierung und ergab eine 100%ige Übereinstimmung, darüber hinaus korrelieren die erhobenen Allelfrequenzen der Kontrollgruppe mit den bekannten Allelfrequenzen in Normalpopulationen. Die Ergebnisse der Real-Time-PCR waren ebenfalls valide reproduzierbar, wie anhand von Intra- und Interassays gezeigt werden konnte. Es zeigte sich keine Assoziation eines IL-4Rα Polymorphismus mit dem Vorliegen von MALT-Lymphomen. Sollte in Lymphomen vom MALT-Typ ein TH2-Zytokinprofil vorliegen, scheinen andere Mechanismen bzw. Prädispositionen als IL-4Rα Polymorphismen diese Polarisierung zu bedingen. Die Real-Time-PCR zeigte bezüglich der IFN-γ und IL-4 mRNA-Expression in MALT-Lymphomen und H. pylori-Gastritiden keine Unterschiede: bei fehlendem IL-4 Nachweis wurde IFN-γ konstant nachgewiesen. Da die H. pylori-Gastritiden als TH1-assoziierte Erkrankungen gelten und IL-4 in den MALT-Lymphomen nicht nachzuweisen war, sprechen die hier vorgelegten Daten für das Vorliegen eines TH1-Zytokinprofils in Lymphomen vom MALT-Typ. Dieses Ergebnis steht im Widerspruch zu Zellkulturversuchen und theoretischen Überlegungen, die eine TH2-Immunantwort in MALT-Lymphomen nahe legen, passt sich aber gut ein in eine Reihe von Untersuchungen, die in Bezug auf den direkten Zytokinnachweis in MALT-Lymphomen ebenfalls zu dem Ergebnis einer IFN-γ/(TH1) Dominanz kommen. Zurzeit kann nicht abschließend beurteilt werden, ob die Lymphome vom MALT-Typ zu den mit einer polarisierten TH-Immunantwort einhergehenden Erkrankungen gehören. Unbestritten bleibt jedoch, dass die MALT-Lymphom-B-Zellen auf eine Form der T-Zellhilfe durch die tumorinfiltrierenden TH-Zellen angewiesen sind. Die aktuelleren Forschungsergebnisse lassen vermuten, dass dieses Phänomen vor allem in frühen Stadien des MALT-Lymphoms relevant ist und mit dem Auftreten von genetischen Aberrationen wie der Translokation (1;18) an Bedeutung verliert

10-Jahres-Überlebensrate von Patienten mit kolorektalem Karzinom in Abhängigkeit vom PIK3CA- und KRAS- Mutations- und Acetylsalicylsäureeinnahmestatus

Je mehr über die molekularen Eigenschaften, die zu Entstehung, Wachstum und Metastasierung des kolorektalen Karzinoms führen, bekannt wird, desto größer wird der Wunsch nach einer individualisierten Therapie für den einzelnen Patienten. Dafür werden molekulare Biomarker benötigt, die anzeigen, ob ein Patient aufgrund seiner Tumoreigenschaften von einer bestimmten Therapie profitieren könnte. In verschiedenen retrospektiven Analysen und Metaanalysen konnte ein Überlebensvorteil durch eine „adjuvante“ Einnahme von Acetylsalicylsäure bei Patienten mit kolorektalem Karzinom gezeigt werden. Als molekularer Biomarker für das Ansprechen der Therapie mit Acetylsalicylsäure wurde der PIK3CA- Mutationsstatus in Erwägung gezogen. Ziel dieser Arbeit war es, zu überprüfen, ob der PIK3CA-Mutationsstatus und der KRAS-Mutationsstatus bei Patienten mit kolorektalem Karzinom geeignete molekulare Biomarker für die „adjuvante“ Therapie mit Acetylsalicylsäure, sowie geeignete prognostische Marker für das Gesamtüberleben, darstellen. In diese retrospektive Analyse wurden 153 Patienten mit Erstdiagnose eines kolorektalen Karzinoms im Jahr 2003/2004 im Universitätsklinikum Marburg eingeschlossen. Die in Paraffin eingebetteten Tumorproben wurden entparaffiniert und es erfolgte die Extraktion der DNA. Der PIK3CA-Mutationsstatus der Tumorzellen wurde mittels Pyrosequenzierung bestimmt und der KRAS-Mutationsstatus mithilfe der Multiplex-Sequenzierung. Der Acetylsalicylsäure-Einnahmestatus sowie das 10-Jahres- Überleben wurden mit Hilfe von Patientenakten und Melderegistern ermittelt. In dieser Arbeit lag eine Mutation im PIK3CA-Gen bei 16% und eine KRAS-Mutation bei 57% der Patienten vor. Die Einnahme von Acetylsalicylsäure erfolgte bei 34% der Patienten und das 10-Jahres-Gesamtüberleben betrug 44%. Es konnte gezeigt werden, dass Patienten mit PIK3CA-Wildtyp einen signifikanten Überlebensvorteil gegenüber Patienten mit PIK3CA-Mutation aufwiesen (Log-rank-Test: HR=0,59; 95% KI=0,29-0,96; p=0,04). Patienten mit regelmäßiger Einnahme von Acetylsalicylsäure zeigten im Gesamtkollektiv keine signifikant verbesserte absolute 10-Jahres-Überlebensrate im Vergleich zu Patienten ohne regelmäßige Einnahme von Acetylsalicylsäure (Log-rank- Test: HR=0,77; 95% KI=0,5-1,22; p=0,29). Unter allen Patienten mit regelmäßiger Acetylsalicylsäure-Einnahme konnte für die Patienten mit PIK3CA-Wildtyp ein signifikanter Überlebensvorteil gegenüber Patienten mit PIK3CA-Mutation aufzeigt werden (Log-rank-Test: HR=0,33; 95% KI=0,05-0,62; p<0,01). Dieser Überlebensvorteil zeigte sich unter den Patienten ohne Acetylsalicylsäure-Einnahme nicht (Log-rank- Test: HR=0,78; 95% KI=0,38-1,51; p=0,43). Bei kombinierter Betrachtung des PIK3CA- und KRAS-Mutationsstatus zeigte sich unter den Patienten mit regelmäßiger Acetylsalicylsäure-Einnahme für Patienten mit PIK3CA-Wildtyp und KRAS-Mutation ein signifikanter Überlebensvorteil gegenüber Patienten mit anderen Kombinationen des Mutationsstatus (Log-rank-Test: HR=0,38; 95% KI=0,17-0,87; p=0,02). Dieser Überlebensvorteil zeigte sich unter den Patienten ohne Acetylsalicylsäure-Einnahme nicht (Log-rank-Test: HR=0,95; 95% KI=0,58-1,57; p=0,84). Für Patienten mit KRAS- Mutation, PIK3CA-Wildtyp und Acetylsalicylsäure-Einnahme zeigte sich ein Trend für einen Überlebensvorteil gegenüber Patienten mit KRAS-Mutation, PIK3CA-Wildtyp ohne Acetylsalicylsäure-Einnahme (Log-rank-Test: HR=0,57; 95% KI=0,30-1,08; p=0,09). Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen zusammenfassend vermuten, dass vor allem Patienten mit der Kombination von PIK3CA-Wildtyp und KRAS-Mutuation von einer Acetylsalicylsäure-Einnahme nach Diagnosestellung des kolorektalen Karzinoms profitieren. Die Studienlage ist diesbezüglich sehr heterogen. In Studien von Liao et al. und Domingo et al. zeigte sich ein signifikant verbessertes Outcome für Patienten mit Mutation im PIK3CA-Gen gegenüber Patienten mit PIK3CA-Wildtyp bei Einnahme von Acetylsalicylsäure. In einer Studie von Reimers et al. zeigten Patienten mit regelmäßiger Acetylsalicylsäure-Einnahme und PIK3CA-Wildtyp ein signifikant längeres Gesamtüberleben gegenüber Patienten mit PIK3CA-Wildtyp ohne regelmäßige Einnahme. Aktuelle Studien von Murphy et al. und Kothari et al. konnten keinen signifikanten Zusammenhang zwischen dem PIK3CA-Mutationsstatus und einer Verlängerung des Gesamtüberlebens bei Einnahme von Acetylsalicylsäure feststellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen zusammenfassend, dass für die Rollen des PIK3CA- und KRAS-Mutationsstatus als mögliche prädiktive Marker für eine „adjuvante“ Therapie mit Acetylsalicylsäure bei Patienten mit kolorektalem Karzinom prospektive Studien erforderlich sind. Aufgrund der aktuellen Studienlage und des nicht zu unterschätzenden Nebenwirkungsprofils von Acetylsalicylsäure sollte bei Patienten mit kolorektalem Karzinom eine „adjuvante“ Therapie mit Acetylsalicylsäure derzeit nur im Rahmen von Studien erfolgen

Auswertung von Ringversuchen zur zytologischen Knochenmark-Diagnostik der Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in medizinischen Laboratorien e.V. (INSTAND)

Auswertung von Ringversuchen zur zytologischen Knochenmark-Diagnostik der Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in medizinischen Laboratorien e.V. (INSTAND) Einleitung: Die zytomorphologische Untersuchung von hämatologischen Erkrank-ungen ist ein bedeutsames diagnostisches Werkzeug. Die Qualität der Diagnostik ist Schwerpunkt des Ringversuches. Insgesamt wurden 1772 Einzelpräparate erstellt und bewertet. Die Bewertungen erfolgten abhängig von der Art des Fehlers und dem Schweregrad der Erkrankung. Alltägliche Erfordernisse an die Zytomorphologie und realistische, klinische Bewertungsmaßstäbe an Diagnose und die Bedeutung für den Patienten flossen in die Beurteilung ein. Unter Berücksichtigung der WHO-Klassifikationen und der gesetzlichen Rahmenbedingungen für Qualitätssicherung wurden die Ergebnisse diskutiert. Methoden: Die Auswahl und Bewertung der Präparate erfolgte zunächst durch einen Referenzzytomorphologen. Unter Zuhilfenahme eines Fragebogen und weniger Zusatzangaben, sollte die Teilnehmer eine zytomorphologische Diagnose erstellen. Die Teilnehmer erhielten abschließend Ergebnis und Fehleranalyse zum Teil durch Videoprints der Präparate erläutert. Die Fehleranalyse war auf die Labore beschränkt, die über 70% der Gesamtpunktzahl erreicht haben. Ergebnisse: Die Diagnosen und Fehlerquoten verteilen sich über 4 Schweregrade mit einer Spannbreite zwischen 0,0 % bis 35,1 %. Ungewöhnlich hoch sind die Quoten bei Nomalbefunden (16,1 %) und myeloproliferative Neoplasien (10,0 %), letztere trotz eindeutigen Laborvorgaben wie z.B. einer deutlichen Thrombozytose über längere Zeit. Falsche Diagnosen finden sich bei der hämolytischen Anämie in 13,9 % und bei der megaloblastären Anämie in 15,1 %, wobei in diese in den meisten Fällen mit einer Myelodysplasie verwechselt worden sind. Bei den Fällen von Myelodysplasien findet sich insgesamt eine Fehlerrate von 23,5 %. Die Fehlerrate bei den MDS-Subtypen liegt bei RARS (11,5 %), RAEB (35,1 %) und 5q-Minus-Syndrom (34,6 %). Bei der akuten Leukämie reicht die Fehlerrate bis 5,6 %. Der Remissionsstatus der AML (7,9 %) und der akuten lymphatischen Leukämie (10,6 %) stellt eine Herausforderung dar, vor allem bei der AML M4 E0. In diesem speziellen Fall haben nur 17,2 % der Teilnehmer ein frühes Rezidiv diagnostiziert. Von einem anderen Blickwinkel aus betrachtet sind Diagnosen, wenn sie von den Teilnehmer gestellt wurden, wie MDS vom Typ RAEB, in 87,9 % der Fälle richtig. Bei reaktiven Veränderungen liegt die Quote der richtigen Diagnose aber nur bei 10,6 %. Ausblick: Neben weitreichenden Fortbildungsangeboten sollte ein Expertenpanel, wie in den laufenden Studien z.B. der CLL- oder AML-Studiengruppe, zur Erstellung einer Referenzdiagnose zur Verfügung stehen. Moderne digitale Medien können helfen die notwenigen Arbeitsabläufe zu vereinfachen

Highs and\it and lows

Why people differ in their susceptibility to external events is essential to our understanding of personality, human development, and mental disorders. Genes explain a substantial portion of these differences. Specifically, genes influencing the serotonin system are hypothesized to be $\textit {differential susceptibility}$ factors, determining a person's reactivity to both positive $\it and$ negative environments. We tested whether genetic variation in the serotonin transporter $\textit {(5-HTTLPR)}$ is a differential susceptibility factor for daily events. Participants ($\it N$ = 326, 77% female, mean age = 25, range = 17–36) completed smartphone questionnaires four times a day over four to five days, measuring stressors, uplifts, positive and negative affect. Affect was predicted from environment valence in the previous hour on a within-person level using three-level autoregressive linear mixed models. The $\textit {5-HTTLPR}$ fulfilled all criteria of a differential susceptibility factor: Positive affect in carriers of the short allele (S) was less reactive to both uplifts and stressors, compared to homozygous carriers of the long allele (L/L). This pattern might reflect relative affective inflexibility in S-allele carriers. Our study provides insight into the serotonin system’s general role in susceptibility and highlights the need to assess the whole spectrum of naturalistic experiences