Application of Ion Mobility-High Resolution Mass Spectrometry and In Silico Tools for Identifying Non-Volatile Substances in Food Contact Material

The use of ion mobility separation (IMS) in conjunction with high-resolution mass spectrometry has proved to be a reliable and useful technique for the characterization of small molecules from food contact materials (FCMs). Collision cross section (CCS) values derived from IMS can be used as a structural descriptor to aid compound identification. One limitation of the application of IMS to the identification of chemicals from FCMs is the lack of published empirical CCS values, thus, this thesis firstly established a CCS database for extractables and leachables from FCMs. On the other hand, many chemicals in FCMs don't have commercial standards, their experimental CCS values cannot be obtained, in this case, machine learning approaches were used to build the models to predict the CCS values for chemicals in FCMs. A support vector machine (SVM) model, based on Chemistry Development Kit (CDK) descriptors, provided the most accurate prediction with 93.3% of CCS values for [M + H]+ adducts and 95.0% of CCS values for [M + Na]+ adducts in testing sets predicted with Besides the CCS values, the retention time (RT) is also very important for the unknown identifications. therefore, we also developed a prediction model to generate the predicted RT values. Based on the in-silico RT and CCS prediction models, a workflow to identify nonvolatile migrates from FCMs was proposed using liquid chromatography-ion mobility-high-resolution mass spectrometry. This workflow was evaluated by screening the chemicals that migrated from polyamide spatulas, we found that the predicted RT and CCS values can reduce the number of candidates and increase the confidence of identification in targeted and suspect screening analysis. The development of a database containing predicted RT and CCS values of compounds related to FCMs can aid in the identification of chemicals in FCMs.<br /

Impacto químico y sensorial de compuestos potencialmente migrantes provenientes de materiales emergentes destinados al contacto alimentario

Esta tesis presentada para obtener el título de Doctor en Ciencia Analítica en Química se enmarca en el campo de la investigación de la seguridad del envase alimentario que está llevando a cabo el Grupo Universitario de Investigación Analítica (GUIA) del Departamento de Química Analítica de la Universidad de Zaragoza. El grupo GUIA está liderado por la Dra. Cristina Nerín de la Puerta y está integrado en el Instituto de Investigación en Ingeniería en Aragón (I3A). La tesis fue desarrollada dentro del proyecto de investigación SENEMs (AGL2015-67362-P) del Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia. Parte de la tesis fue realizada en el Institute for Global Food Security de Queen´s University Belfast, durante una estancia de tres meses financiada parcialmente por el programa European Community Action Scheme for the Mobility of University Students Plus (ERASMUS +).Esta tesis doctoral se centra en el estudio de los compuestos migrantes que se transfieren desde envases emergentes hacia simulantes alimentarios. Concretamente en los compuestos odorantes que pueden afectar la calidad del alimento y los potenciales migrantes provenientes de un material para cocinado en envase y biopolímeros. Para ello se ha realizado un estudio exhaustivo de la composición de estos materiales, se han determinado algunos de los parámetros de migración más influyentes y se han establecido librerías de los potenciales migrantes. Todo ello se ha logrado por medio de la optimización de una gran variedad de técnicas de tratamiento de muestras, y de la implementación de potentes técnicas analíticas para la detección y cuantificación de los compuestos. La memoria es una colección de seis capítulos y cada uno de ellos expone un proyecto de investigación independiente que representa los resultados más relevantes de un proyecto de investigación novedoso en el campo de la química analítica. El capítulo 1 se establece una metodología para el análisis de isoftalaldehído en muestras de migración acuosas provenientes de envases de PET destinados al contacto alimentario. Para ello fueron evaluadas tres técnicas de tratamiento de muestras y se desarrolló un método de detección y cuantificación por cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas. También, se analizó la influencia de los parámetros de tiempo y temperatura en los resultados de migración. Finalmente, se estableció que la técnica de microextración en fase liquida por fibra hueca brindaba los mejores resultados para la cuantificación En el Capítulo 2 se realizó la caracterización del perfil sensorial de bolsas para cocinado en horno, enfocado en los compuestos odorantes que pueden generar atributos sensoriales negativos en los alimentos. Para ello se evalúo y comparó el efecto de la cocción mediante horno convencional y horno microondas a la vez que se optimizo la técnica de microextracción en fase sólida por espacio de cabeza. Adicionalmente se estableció un protocolo de análisis para los compuestos odorantes provenientes de muestras de migración y alimentos. Finalmente fue posible establecer una librería con los potenciales migrantes odorantes de cada material de cocinado.En el capítulo 3, se determinaron los principales NIAS volátiles y semi-volátiles provenientes de un nuevo biopolímero base almidón. Para ellos se desarrollaron y optimizaron varias técnicas de identificación y cuantificación, entre ellas se implementó la técnica de ionización a presión atmosférica APGC-Q/ToF. Finalmente, se estableció una librería con los potenciales migrantes NIAS volátiles y se determinó el grado de toxicidad teórica de cada uno de ellos. En el capítulo 4, se realizó la caracterización del perfil aromático y la evaluación de la presencia de atributos sensoriales negativos de pellets y películas de bioplásticos base almidón destinados para la fabricación de utensilios de cocina y envases alimentarios. Para ello se identificaron los potenciales migrantes odorantes para cada tipo de material, y se evaluaron los principales atributos sensoriales correlacionándolos con los principales odorantes identificados. Los resultados de esta investigación lograron mostrar un patrón de relación entre los atributos negativos del material y defectos en la calidad sensorial de los simulantes. En el capítulo 5, se estableció una metodología de análisis para la detección rápida y simultanea de oligómeros de poliésteres provenientes de un material de PLA y un biopolímero base almidón, mediante las técnicas de análisis a presión atmosférica acopladas a un espectrómetro de masas, DART-SVP y ASAP-Q/ToF. Para la detección de los principales aductos de cada familia de oligómeros se realizaron los ensayos de migración secuencial para los materiales de uso repetido siguiendo los protocolos establecidos por la legislación, para facilitar el proceso de elucidación de las familias de oligómeros de poliéster migrantes. Finalmente se elaboró una librería de los aductos detectados de cada uno las series de oligómeros de poliéster migrantes y se determinó la idoneidad de las metodologías de detección rápida de oligómeros de poliésteres.En el capítulo 6, se estableció un protocolo para el análisis de los compuestos migrantes, provenientes de utensilios de cocina comerciales fabricados con un biopolímero base bambú, mediante tres metodologías diferentes establecidas previamente en los anteriores capítulos. Además, se desarrolló una librería con los principales migrantes, volátiles, no volátiles, sus aductos y los NIAS provenientes de la resina de melamina, estableciendo valores de migración para cada uno de ellos. CONCLUSIONES GENERALESA partir del desarrollo y los resultados obtenidos en cada uno de los capítulos de la esta Tesis se demostró que:El desarrollo de metodologías analíticas con alta resolución son herramientas de gran utilidad, para evaluar el impacto químico de un material destinado al contacto con alimentos. En ese supuesto, la cromatografía acoplada a espectrometría de masas ha probado ser una herramienta muy poderosa. Las técnicas APGC-Q/ToF y GC-EI-MS para la identificación de los compuestos volátiles y semi-volátiles son técnicas complementarias, porque la espectrometría de masas de alta resolución permite complementar la información obtenida por EI. Por otro lado, la técnica UPLC-Q/ToF ha evidenciado ser una herramienta muy útil en el proceso de identificación de NIAS, permitiendo obtener la masa exacta del ion molecular y de los aductos formados, además del patrón de fragmentación que facilita el proceso de elucidación estructural de compuestos.Evaluar el impacto sensorial de un material destinado al contando con alimentos, es de gran relevancia para poder definir los posibles defectos que el envase pudiera generar en las propiedades organolépticas, y por tanto la calidad del alimento. La técnica HS-SPME, que permite obtener un extracto representativo del aroma, combinada con la técnica GC-MS-O para la detección e identificación de los compuestos volátiles odorantes han mostrado ser una combinación apropiada para la determinación de este impacto sensorial.<br /

Síntesis y aplicación de nanomateriales para el desarrollo de envases activos antioxidantes y antimicrobianos

La seguridad alimentaria es necesaria para que la población tenga acceso a alimentos seguros y en cantidad suficiente para cubrir sus necesidades nutricionales. Por ello, es necesario reducir las pérdidas y el deterioro de los alimentos producido por microorganismos y procesos de oxidación, así como las enfermedades alimentarias ocasionadas por microorganismos patógenos contaminantes y sus metabolitos. El envasado tradicional no es capaz de dar respuesta estos problemas, por ello es necesario el desarrollo de envases activos alimentarios. Éstos permiten alargar la vida útil de los alimentos gracias al uso de agentes activos, entre los cuales se destacan los antimicrobianos y los antioxidantes cuyos objetivos son reducir el crecimiento bacteriano y los procesos de oxidación, respectivamente. El desarrollo de estos nuevos envases, a día de hoy, debe partir de un principio de sostenibilidad que reduzca los niveles de contaminación ambiental producidos a nivel global por los envases de plástico. Por ello, se debe primar la utilización de materiales de envase compostables y/o biodegradables y respetuosos con el medio ambiente. Con el objetivo de buscar nuevas soluciones de envase activo para reducir la pérdida y desperdicio de alimentos, a lo largo de esta tesis doctoral se ha explorado el uso de nuevos agentes activos antimicrobianos y antioxidantes basados en nanomateriales o moléculas nanoestructuradas para el desarrollo de nuevos envases activos alimentarios. Se ha investigado, por primera vez, el uso de polioxometalatos (POM) y nanoesponjas de ciclodextrina (CDNS) en la encapsulación de compuestos orgánicos volátiles (COV) para el desarrollo de envases activos utilizando, siempre que ha sido posible, materiales biodegradables y/o compostables, como el ácido poliláctico (PLA), el polivinil alcohol (PVA), la carboximetil celulosa (CMC) y las CDNS. Estos polímeros han sido la base para los envases antioxidantes que se han desarrollado a partir de POM de Mo para la eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y los antimicrobianos a partir de POM de W y las encapsulaciones de COV en CDNS para combatir los mohos contaminantes de alimentos. Los procesos de oxidación ocasionados por las ROS en F&V provocan pardeamiento y ablandamiento frutas, permitiendo que sean fácilmente infectadas por microorganismos, por lo que es necesario evitar estos procesos de oxidación, principalmente en frutas de IV gama, debido a las heridas mecánicas que sufren durante su procesado. Para intentar solucionar este problema derivado de la rápida oxidación de fruta de IV gama envasada, se estudió la utilización de POM de Mo reducidos como agente activo en el desarrollo de un envase activo antioxidante. En primer lugar, se sintetizó el POM reducido (NH4)15{Na[(Mo2VO4)6(µ2-SO3)3(µ6-SO3)]2}·5H2O (POMo) que se utilizó para el desarrollo de un envase activo antioxidante para frutas de IV gama. El POMo obtuvo un índice de actividad antioxidante (AAI) muy fuerte en el ensayo de eliminación de radicales DPPH¿ (AAI = 3,15). Posteriormente, se estudió su capacidad para captar radicales libres hidroxilo in situ, preparando un recubrimiento de PVA y POMo (4 y 10 %) que se extendió en films de PLA con los que se hicieron bolsas, a través de las cuales se hizo pasar un flujo de OH¿ que reaccionaba, al salir de la bolsa, con una disolución de ácido salicílico formando 2,5-dihidroxibenzoico. El recubrimiento de PVA-POMo fue capaz de reducir la hidroxilación del ácido salicílico en un 39,1 % para PVA-POMo 4 % y en un 51,1 % para PVA-POMo 10 %. A continuación, se prepararon los envases antioxidantes pegando con un adhesivo un film de PLA (12x17 cm) recubierto con PVA-POMo 4 % y 10 % en bandejas compostables de caña de azúcar. En el interior de las bandejas se colocaron las rodajas de melocotón, con o sin tratamiento en un baño antioxidante. El envase antioxidante PVA-POMo 4 % fue el que mejor se comportó ya que fue capaz de mantener el color y retrasar el pardeamiento del melocotón sin baño antioxidante previo, sin afectar al proceso de maduración del melocotón. También se evaluó la producción de volátiles característicos del aroma del melocotón como la ¿-dodecalactona, ¿-decalactona o benzaldehído, que son críticos para la aceptación del consumidor y se observó que el PVA-POMo 4 % mantenía o mitigaba su disminución respecto al control y al PVA-POMo 10 %.Otra de las categorías de alimentos envasados cuya seguridad alimentaria tiene especial relevancia son los alimentos listos para el consumo (RTE), ya que microorganismos patógenos como Listeria monocytogenes o Escherichia coli que se encuentran comúnmente en estos alimentos, son responsables de causar graves enfermedades en el caso de ingesta de alimentos contaminados. En este caso, se desarrolló un envase activo con propiedades antimicrobianas, explorando la utilización de un complejo antimicrobiano entre un POM de W (K8[SiW11O39]). y el conservante alimentario etil lauroil arginato (LAE). Este complejo se denominó POM-LAE y se utilizó para desarrollar un film activo antimicrobiano, para alimentos RTE, que mantuviese la actividad antimicrobiana en el tiempo ya que la formación de este complejo permitía superar la limitación del uso del LAE derivada de su pérdida brusca de actividad derivada de su rápida solubilidad acuosa, ya que el complejo POM-LAE es insoluble en agua. El POM-LAE demostró tener actividad antimicrobiana frente distintas bacterias patógenas alimentarias, especialmente frente a L. monocytogenes, con valores de MIC de 32 µg/mL y de MBC de 128 µg/mL, mientras que frente a E. coli se obtuvieron valores de MIC de 64 µg/mL y una MBC de 128 µg/mL. Estos ensayos de susceptibilidad antimicrobiana demostraron que las concentraciones de LAE necesarias para inhibir el crecimiento bacteriano eran hasta dos veces menores en el complejo POM-LAE, en comparación con el LAE libre. El complejo POM-LAE presenta un mecanismo de acción en las células bacterianas similar al del LAE, afectando la membrana celular, como se comprobó por citometría de flujo y SEM. El POM-LAE también demostró actividad antibiofilm, tanto para inhibir la formación de biofilm como para eliminar el biofilm formado de L. monocytogenes y de E. coli a concentraciones de 32 µg/mL. Habiendo verificado que el complejo POM-LAE era más efectivo frente a L. monocytogenes, se desarrollaron films de CMC por casting y de PLA por extrusión con POM-LAE. Los films de PLA-POM-LAE 5 % no tuvieron actividad antimicrobiana in vitro, mientras que los films de CMC-POM-LAE 5 y 10 % consiguieron reducir la concentración bacteriana de L. monocytogenes 7 y 8 log(UFC/mL), respectivamente. Finalmente, los films de CMC-POM-LAE 5 y 10 % fueron utilizados para controlar el crecimiento de L. monocytogenes como film separador entre lonchas de jamón curado. Ambos films de CMC-POM-LAE consiguieron evitar el crecimiento bacteriano durante los primeros días y mantener la población bacteriana por debajo de la del control durante el ensayo. Además de las contaminaciones bacteriana, también las contaminaciones de alimentos por mohos causa graves pérdidas de alimentos debido a su ubiquidad y también el desarrollo de enfermedades resultantes de la ingesta de micotoxinas. Así, es necesario el desarrollo de nuevos envases activos antifúngicos capaces de inhibir el crecimiento de los mohos en distintos tipos de alimentos. Para ello se encapsularon varios COV en CDNS para obtener una forma fácil y sencilla de incorporar compuesto líquidos volátiles en envase activo antimicrobiano y que permitiera una actividad sostenida en el tiempo. En primer lugar, se comprobó la actividad antifúngica de cinco COV: diacetilo, benzaldehído, 2-etilhexanol, acetofenona y 2-nonanona frente a varios mohos causantes de deterioro en alimentos. Se hicieron ensayos en fase vapor usando los COV frente a Aspergillus niger, Botrytis cinerea y Penicillium expansum, siendo el diacetilo, el benzaldehído y el 2-etilhexanol los que fueron capaces de inhibir completamente el crecimiento de los tres mohos. A continuación, se procedió a encapsular estos tres COV en nanoesponjas de ¿-ciclodextrina (¿-CDNS) y ß-ciclodextrina (ß-CDNS) para disminuir la volatilización de estos compuestos y generar un agente activo susceptible de ser más fácilmente incorporado a un envase. Los encapsulados de diacetilo (¿- y ß-CDNS-diacetilo) y benzaldehído (¿- y ß-CDNS-benzaldehído) fueron capaces de inhibir completamente el crecimiento de los mohos estudiados, a excepción de ¿-CDNS-benzaldehído frente a A. niger. Los COV encapsulados en ß-CDNS demostraron ser más efectivos que los de ¿-CDNS, siendo el más eficaz el de diacetilo, ya que ß-CDNS-diacetilo inhibió el crecimiento de los mohos con 10 mg (P. expansum) o 25 mg (A. niger y B. cinerea), mientras que ß-CDNS-benzaldehído inhibió el crecimiento a 25 mg (P. expansum y B. cinerea) y 50 mg (A. niger). El SEM permitió observar que el daño estructural producido por los encapsulados de diacetilo y benzaldehído fue similar al descrito para otros compuestos volátiles como los aceites esenciales y se comprobó que tanto A. niger y B. cinerea eran susceptibles a cantidades subinhibitorias de encapsulados de ß-CDNS-diacetilo y ß-CDNS-benzaldehído, respectivamente. La mayor actividad de los encapsulados en ß-CDNS se observa en la diferencia de liberación del diacetilo (36,2 mg/g¿-CDNS y 42,2 mg/gß-CDNS) y del benzaldehído (40,9 mg/g¿-CDNS y de 50,5 mg/gß-CDNS). Además, la eficiencia de encapsulación del diacetilo en ß-CDNS fue del 13,9 % (137,9 mg/g) frente a la de ¿-CDNS que fue del 9,7 % (96,1 mg/g), mientras que la del benzaldehído en ß-CDNS fue del 18,5% (192 mg/g) frente a la de ¿-CDNS que fue del 14,2 % (148 mg/g). Por último, se desarrolló un prototipo de bolsitas de polipropileno con los encapsulados de diacetilo y benzaldehído en ¿- y ß-CDNS en su interior para permitir la versatilidad y compatibilidad de estas formulaciones con distintos tipos de envases. La incorporación de los encapsulados en las bolsitas de PP no afectó la actividad antifúngica de estos, consiguiendo mantener la actividad antifúngica de los encapsulados frente a los tres mohos.En conclusión, en esta tesis se evalúa la actividad antioxidante y antimicrobiana de nuevos compuestos para su utilización como agentes activos en envase activo alimentario, siendo capaces de ofrecer nuevas alternativas a la problemática del deterioro y pérdidas alimentarias. Para esta razón, se desarrollaron varios prototipos de envase activo que se probaron con éxito en alimentos susceptibles al deterioro oxidativo (melocotón) y a la contaminación por bacterias patógenas (jamón curado), junto con un nuevo antifúngico basado en la encapsulación de compuestos orgánicos volátiles que demostró gran eficacia frente a mohos s contaminantes de los alimentos que causan su deterioro. <br /