Interaction of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase with SH-containing compounds: evidence for the binding of l-cysteine and for the dependence of the binding on the functional state of the enzyme

AbstractIncorporation of l-[35S]cysteine into rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase was detected following incubation of the enzyme in a mixture containing glyceraldehyde-3-phosphate, NAD+ and the labeled cysteine. Insignificant binding occurred in the absence of either the substrate or NAD+, suggesting that formation of an acylated enzyme form was a prerequisite for the binding. Stoichiometry of the binding depended on the number of functioning active centers; up to 4 moles of l[35S]cysteine bound per mole tetramer with fresh enzyme preparations. The l-[35S]cysteine incorporation depended on pH and was maximal when a group having pKa of 8.5 is protonated. To clarify the relevance of this finding to the effect of SH-containing compounds previously shown to decrease the rate of 3-phosphoglyceroyl-enzyme hydrolysis [Kuzminskaya et al., FEBS Lett. 336 (1993) 208–210], the pH-dependence of the effect of glutathione on the hydrolysis rate was determined and found to be close to the pH-dependence of l-[35S]cysteine binding

An unusual effect of NADP + on the thermostability of the nonphosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Streptococcus mutans

International audienceLa calorimétrie différentielle à balayage adiabatique a été utilisée afin d’examiner l’effet du NADP+ sur la dénaturation thermique irréversible de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase non phosphorylante (GAPN) de Streptococcus mutans. Le complexe binaire GAPN-NADP+ présente une stabilité thermique fortement diminuée, avec une différence d’environ 20 °C entre les températures maximales des pics de transition thermique comparativement à la protéine libre. Ce résultat est similaire à ce qui avait été précédemment décrit sur la déstabilisation thermique de la GAPN consécutive à la liaison d’un phosphate inorganique au site de liaison du substrat. Ceci peut être interprété comme un déplacement de l’équilibre entre deux conformères de la GAPN tétramérique à la suite de la liaison du coenzyme. Une substitution simple d’un acide aminé connue pour abolir la liaison du NADP+ annule l’effet calorimétrique du coenzyme. Fait remarquable, l’inactivation thermique de la GAPN est considérablement ralentie en présence de NADP+, montrant que le changement apparent de stabilité du centre actif peut résulter en des effets opposés à ceux de la protéine entière. Le NADP+ peut aussi réactiver la GAPN* inactive obtenue par chauffage de l’apoenzyme à une température inférieure à la température de transition thermique. Ces effets pourraient refléter un mécanisme qui donne à la GAPN la flexibilité nécessaire aux importantes réorganisations conformationnelles observées précédemment dans le site actif, requises durant le cycle catalytique. La stabilité thermique élevée de l’apoenzyme pourrait, en retour, constituer un élément important pour le maintien d’un niveau constant de GAPN active – une enzyme essentielle à la production d’équivalents réducteurs chez S. mutans et à sa capacité à croître en conditions aérobies