神経の分化と遺伝子に関する研究

金沢大学がん研究所研究課題/領域番号58570086, 研究期間(年度):1983 – 1984出典：研究課題「神経の分化と遺伝子に関する研究」課題番号58570086（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-58570086/）を加工して作

赤血球による窒素酸化物の処理機構に関する研究

金沢大学がん研究所研究課題/領域番号:X00023----503509, 研究期間(年度):1980出典：「赤血球による窒素酸化物の処理機構に関する研究」研究成果報告書　課題番号X00023----503509（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-X00023----503509/）を加工して作

遺伝性網膜疾患のDNA診断と標準化

大阪大学医学部 / 金沢大学医学部X染色体性網膜色素変性症に対してはL1.28プロ-ブ、色盲に対しては赤、緑、青のプロ-ブ、夜盲症に対してはオプシンプロ-ブ、Grayアトロフィ-に対してはオルニチンアミノトラシスフェラ-ゼ、レ-バ-病に対してはミトコンドリアの或るDNAプロ-ブ、網膜芽腫に対してはRb遺伝子と言うように、近年遺伝性網膜疾患の原因遺伝子が明らかとなったり、原因遺伝子の近くのDNAフラグメントが得られ、遺伝子診断が可能となっている。本年度は、DNA診断のための詳細な手抜マニュアルを作製した。また、網膜色素変性症のDNA診断をL1.28プロ-ブを用いて、レ-バ-病の診断をミトコンドリアDNAプロ-ブを用いて行った。グレイアトロフィ-の原因遺伝子であるオルニチンアシノトランスフェラ-ゼの網膜内局在について調べた。また、網膜視細胞に特異的な遺伝子であるMEKA cDNAをクロ-ニングし、その蛋白質の諸性質を明らかにした。錯体細胞に特異的なvisinin cDNAのクロ-ニングも行い、これがカルシウム結合蛋白質であることを明らかにした。遺伝子診断を行うときは、その原因遺伝子が明らかな場合は、疾患のDNAから直接診断できるが、原因遺伝子が明らかでない場合は、その近くの適当なプロ-ブを用いることになる。その場合はリンケ-ジアナリシスが必要である。遺伝性網膜疾患の場合、遺伝様式の明らかな大きな家系を見つけることが大変困難であることが分かった。DNA診断をする場合には、原因遺伝子の分かったプロ-ブを使用して行うべきであり、なるべくリンケ-ジアナリシスにたよらないことが望ましい。また、眼科医自らが、DNA診断を行うことが望まれる。この研究班が始まって以来、眼科領域で、遺伝子への関心が高まったことは、大きな成果であった。The retina has many hereditary diseases compared to other tissues. Recently the locus genes or the genes close to the locus have been isolated such as L1.28 for retinitis pigmentosa, red, blue and green genes for color blindness, ornithine aminotransferase for Gray\u27s atrophy, mitochondrial DNA for Leber\u27s disease, Opsin for night blindness, Rb gene for retinoblastoma. Diagnosis by restriction fragment polymorphism(RFP) was applied to retinitis pigmentosa and Leber\u27s disease using L1.28 and mitochondrial DNA probes, respectively. The distribution of ornithine aminotransferase which is a locus gene of Gray\u27 atrophy was studied immunohistochemically in the retinas. The structures and functions of two retina-specific CDNAs (MEKA and visinin) were studied and it was found that MEKA protein is associated with beta- and gamma- subunits of transducin, and visinin is a calciumbinding protein in the cone cells. Pigment epithelium-specific cDNA clone (MM115) was also isolated and it had a protease inhibitory activity. It is suggested that a clinician should perform the DNA-diagnosis for himself and use the locus DNA for a probe, not a probe which needs the linkage analysis.研究課題/領域番号:62870071, 研究期間(年度):1987 – 1989出典：研究課題「遺伝性網膜疾患のDNA診断と標準化」課題番号62870071（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-62870071/628700711989kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

神経突起伸展因子の作用機作に関する研究

金沢大学がん研究所神経突起伸展因子(NOF)を認識し, これと結合する分子(受容体)は, 筋肉側にも, 神経側にも存在するものと考えられる. そこで今回は, 筋肉側の膜分画に存在し, NOFと結合し, かつNOFの生物活性(突起伸展活性)を阻害する分子について追求したので報告する. ニワトリ砂嚢平滑筋の膜分画を0.5%Nonidet p-40で抽出し, その20万g, 60分の上滑をNP-40抽出液とした. 各種濃度のNOFを培養皿に塗布し, 300μgのNP-40抽出液を加えていくと, NOFの突起伸展活性が抑えられた. また一定量のNOFを培養皿に塗布して, NP-40抽出液を漸次増加していくと, NOFの突起伸展活性は30μg/wellで完全に抑えられた. 一方, ラミニンによる突起伸展作用はNP-40抽出液では抑えられなかった. NP-40抽出液は毛様体ニューロンの生存や, 基壁への細胞の結合に対しては影響を与えなかった. トリプシン処理や熱処理で, HP-40抽出液の活性は消失した. DTT処理では活性の低下が見られS-S結合の関与が示唆された. 骨格筋は筋胃とほぼ同程度の活性が存在したが, 大脳の活性は, 筋肉の約1/6であった. NP-40抽出液の阻害活性をもつ成分がNOFと結合するかどうかを調べるために, リカンドフロッティングを行ったところ, 82KDaの蛋白バンドにNOFと結合することが分った. この蛋白質を各種カラムを用いて部分精製した. この部分精製したサンプルをSDSゲル電気泳動にかけ, ゲルをスライスして活性を調べた所, 82KDaの主バンドにNOFの作用を阻害する活性が存在した. lamininに結合する物質(CSAT antigen)やlaminin受容体が知られているが, これらはlaminin細胞結合ドメインと親和性がある. 我々の82KDaの蛋白質はNOFの細胞結合ドメインではなく, 突起伸展ドメインを認識するようである. 今後, 82KDaの蛋白質の精製を進めると共に, 82KDaの蛋白質に対する抗体を作製し, NOF受容体について検討を進めていく予定である.研究課題/領域番号:62221016, 研究期間(年度):1986 – 1987出典：研究課題「神経突起伸展因子の作用機作に関する研究」課題番号62221016（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-62221016/）を加工して作

培養神経細胞を用いてのムスカリン性シナプス形成に関する研究

金沢大学がん研究所研究課題/領域番号:56221009, 研究期間(年度):1981出典：「培養神経細胞を用いてのムスカリン性シナプス形成に関する研究」研究成果報告書　課題番号56221009（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-56221009/）を加工して作

神経突起伸展因子の作用機作に関する研究

金沢大がん研究所培養神経細胞の突起伸展反応の機構を明らかにすることを目的とし、ニワトリ砂嚢平滑筋より精製した神経突起伸展因子(NOF)に対するモノクロナル抗体を作製し、その免疫化学的性質や末梢神経細胞上へのNOF蓄積などを調べた。NOFに対するモノクロナル抗体を産生するハイブリドーマ(55種)を得た。その内、4種の抗体(4-2C,M1-2G,1-4D、及び5-10A、すべて1gG(K鎖)タイプ)について、更に詳細に調べた。前者2種の抗体は、ウエスタンブロット法により、NOFそのもの(700kDa)とそのサブユニット(200kDa)と反応したが、後2者S-結合をもつ700kDa NOFとのみ反応した。モノクロナル抗体(1-4D)を用いた細胞組織化学を行うと、末梢の筋細胞や、神経細胞膜上にNOFが存在することが確められた。次に加齢に判うCGニューロン上のNOF量の変化とCGニューロンのNOFに対する反応性を調べた。NOF量はニワトリ8日齢胚より増加し15日齢胚で最大となった。NOFに対するCGニューロンの応答性は逆に、8日目より15日までに急激に減少して行った。またこの加齢に伴い蓄積されていくNOFは、8日齢胚では700kDa NOF分子のみしか存在しなかったが、その後10日齢以降では80kDa NOF分子種の存在も認められた。一方、筋細胞の培養液中には逆に800kDaのみが存在しており、筋抽出液中では両方存在していた。モノクロナル抗体1-4DをSephayose CL-2Bに結合させたカラムを用いて、免疫アフィニティーカラムクロマトグラフィーを行った。砂嚢平滑筋粗抽出液より、純度80%以上のNOF標品が回収できたこの後、ゲルロ過クロマトグラフィーにより、NOFの精製度を95%以上にすることができた。NOFをエラステースで切断した140kDaフラグメント(F-140)には細胞結合活性が存在し、F-140抗体によりNOFの結合作用が阻害された。研究課題/領域番号:61231012, 研究期間(年度):1986出典：研究課題「神経突起伸展因子の作用機作に関する研究」課題番号61231012（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-61231012/）を加工して作

Kheper, a Novel ZFH/δEF1 Family Member, Regulates the Development of the Neuroectoderm of Zebrafish (Danio rerio)

AbstractKheper is a novel member of the ZFH (zinc-finger and homeodomain protein)/δEF1 family in zebrafish. kheper transcripts are first detected in the epiblast of the dorsal blastoderm margin at the early gastrula stage and kheper is expressed in nearly all the neuroectoderm at later stages. kheper expression was expanded in noggin RNA-injected embryos and also in swirl mutant embryos and was reduced in bmp4 RNA-injected embryos and chordino mutant embryos, suggesting that kheper acts downstream of the neural inducers Noggin and Chordino. Overexpression of Kheper elicited ectopic expansion of the neuroectoderm-specific genes fkd3, hoxa-1, and eng3, and the ectopic expression of hoxa-1 was not inhibited by BMP4 overexpression. Kheper interacted with the transcriptional corepressors CtBP1 and CtBP2. Overexpression of a Kheper mutant lacking the homeodomain or of a VP16–Kheper fusion protein disturbed the development of the neuroectoderm and head structures. These data underscore the role of Kheper in the development of the neuroectoderm and indicate that Kheper acts as a transcriptional repressor

Cadherin activity is required for activity-induced spine remodeling

Neural activity induces the remodeling of pre- and postsynaptic membranes, which maintain their apposition through cell adhesion molecules. Among them, N-cadherin is redistributed, undergoes activity-dependent conformational changes, and is required for synaptic plasticity. Here, we show that depolarization induces the enlargement of the width of spine head, and that cadherin activity is essential for this synaptic rearrangement. Dendritic spines visualized with green fluorescent protein in hippocampal neurons showed an expansion by the activation of AMPA receptor, so that the synaptic apposition zone may be expanded. N-cadherin-venus fusion protein laterally dispersed along the expanding spine head. Overexpression of dominant-negative forms of N-cadherin resulted in the abrogation of the spine expansion. Inhibition of actin polymerization with cytochalasin D abolished the spine expansion. Together, our data suggest that cadherin-based adhesion machinery coupled with the actin-cytoskeleton is critical for the remodeling of synaptic apposition zone

Methamphetamine induces endoplasmic reticulum stress related gene CHOP/Gadd153/ddit3 in dopaminergic cells

We examined the toxicity of methamphetamine and dopamine in CATH.a cells, which were derived from mouse dopamine-producing neural cells in the central nervous system. Use of the quantitative real-time polymerase chain reaction revealed that transcripts of the endoplasmic reticulum stress related gene (CHOP/Gadd153/ddit3) were considerably induced at 24–48 h after methamphetamine administration (but only under apoptotic conditions), whereas dopamine slightly induced CHOP/Gadd153/ddit3 transcripts at an early stage. We also found that dopamine and methamphetamine weakly induced transcripts for the glucose-regulated protein 78 gene (Grp78/Bip) at the early stage. Analysis by immunofluorescence microscopy demonstrated an increase of　CHOP/Gadd153/ddit3 and Grp78/Bip proteins at 24 h after methamphetamine administration. Treatment of CATH.a cells with methamphetamine caused a re-distribution of dopamine inside the cells, which mimicked the presynaptic activity of neurons with cell bodies located in the ventral tegmental area or the substantia nigra. Thus, we have demonstrated the existence of endoplasmic reticulum stress in a model of presynaptic dopaminergic neurons for the first time. Together with the recent evidence suggesting the importance of presynaptic toxicity, our findings provide new insights into the mechanisms of dopamine toxicity, which might represent one of the most important mechanisms of methamphetamine toxicity and addiction