Chemokines in tumor development and progression

Chemokines were originally identified as mediators of the inflammatory process and regulators of leukocyte trafficking. Subsequent studies revealed their essential roles in leukocyte physiology and pathology. Moreover, chemokines have profound effects on other types of cells associated with the inflammatory response, such as endothelial cells and fibroblasts. Thus, chemokines are crucial for cancer-related inflammation, which can promote tumor development and progression. Increasing evidence points to the vital effects of several chemokines on the proliferative and invasive properties of tumor cells. The wide range of activities of chemokines in tumorigenesis highlights their roles in tumor development and progression. © 2011 Elsevier Inc. All rights reserved

Pathophysiological roles of Pim-3 kinase in pancreatic cancer development and progression

Pim-3 is a member of the provirus integration site for Moloney murine leukemia virus (Pim) family proteins that exhibit serine/threonine kinase activity. Similar to the other Pim kinases (Pim-1 and Pim-2), Pim-3 is involved in many cellular processes, including cell proliferation, survival, and protein synthesis. Although Pim-3 is expressed in normal vital organs, it is overexpressed particularly in tumor tissues of endoderm-derived organs, including the liver, pancreas, and colon. Silencing of Pim-3 expression can retard in vitro cell proliferation of hepatocellular, pancreatic, and colon carcinoma cell lines by promoting cell apoptosis. Pim-3 lacks the regulatory domains similarly as Pim-1 and Pim-2 lack, and therefore, Pim-3 can exhibit its kinase activity once it is expressed. Pim-3 expression is regulated at transcriptional and post-transcriptional levels by transcription factors (e.g., Ets-1) and post-translational modifiers (e.g., translationally-controlled tumor protein), respectively. Pim-3 could promote growth and angiogenesis of human pancreatic cancer cells in vivo in an orthotopic nude mouse model. Furthermore, a Pim-3 kinase inhibitor inhibited cell proliferation when human pancreatic cancer cells were injected into nude mice, without inducing any major adverse effects. Thus, Pim-3 kinase may serve as a novel molecular target for developing targeting drugs against pancreatic and other types of cancer

単球走化活性化因子の免疫学的測定法の確立とその臨床的意義の検討

金沢大学がん研究所研究成果は次のようにまとめることができる。1)ヒトMCAF遺伝子をマウス骨髄腫細胞に導入し、恒常的に高濃度のヒトMCAFを産生する細胞株を樹立した。この細胞培養上清より精製純品を得、これがマウスの緑膿菌・チフス菌の致死的感染を顆粒球芽$減少している状況でも予防することを認めた。2)ヒトMCAFに対する100pg/mlから10ng/mlの範囲で測定可能である酵素免疫測定法を確立した。この測定系を用いて、免疫賦活剤であるOK-432を癌性胸膜炎患者胸腔内に投与時に胸腔内MCAF濃度が上昇すること、ヒト・グリオブラストーマ細胞株がMCAF産生能があることを認めた。現在、この測定系を用いて、臨床材料について検討を加えている。3)MCAFの近縁分子の一つであるインターロイキン8(IL-8)の種々の炎症反応における役割を、抗体投与によって検討した。その結果、LPS投与による急性皮膚炎・肺再灌流障害に認められる、好中球を主体とする白血球侵潤とそれに伴う組織障害に、局所で産生されているIL-8が原因物質として深く関与していることを明らかにした。4)ヒトIL-8に対する酵素免疫学的測定法を用いて、尿路感染症患者尿中でIL-8濃度が特異的に上昇することを認めた。さらに、腎組織に白血球侵潤が認められるループス腎炎・急性糸球体腎炎・急性増悪時のIgA腎症などにおいて、尿中IL-8濃度が有意に上昇していることを認めた。これらの結果は、尿中IL-8濃度の測定が、尿路疾患の新たな有用な診断法になりうる可能性を示していると考えられる。以上の研究と並行して、IL-8遺伝子発現調節機構の分子生物学的解析を行った。その結果、IL-8遺伝子上流域に存在するNF-kB領域が、IL-8遺伝子発現に重要であることを確認した。The results of the project is summarized as follows.1. We established MCAF-producing cell line by transfecting MCAF cDNA into a mouse myeloma cell line and purified MCAF from the culture supernatants of this cell line. We observed that the preadministration of purified recombinant MCAF could prevent either normal or granulocytopenic mice from lethal infection caused by pseudomonas aeruginosa o r Salmonella typhymurium.2. We established a specific and sensitive ELASA against human MCAF.Using this ELASA, we observed that the pleural fluid levels of MCAF increased in patients with malignant pleurisy upon the administration of an immunomodulator, OK-432. In addition, most human glioblastoma cell lines could produce MCAF in response to IL-1 or TNFalpha, suggesting a potential role of MCAF in tumor immunity.3. We also examined the role of MCAF-related molecule, interleukin-8 (IL-8) in the acute inflammation by administering a neutralizing antibody against IL-8. these experiments demonstrated that IL-8 plays an essential role in neutrophil infiltration and neutrophi-dependent tissue injuries in lipopolysaccharide-induced dermatitis and lung reperfusion injury.4. The determination of urinary IL-8 lavels using ELISA revealed that urinary IL-8 levels increased in the urines of patients with urinary tract infections and those with several types of glomerulonephritis such as lupus nephritis, acute glomerulonephritis, and IgA nephropathy with acute exacerbations.These results imply that the determination of urinary IL-8 level can be used for diagnosing and monitoring several diseases in urinary tracts.In addition, we explored the molecular biological aspects of IL-8 gene activation and established that NF_B site was essentially involved in the transcription of IL-8 gene in every cell line that we examined.研究課題/領域番号:04671430, 研究期間(年度):1992 – 1993出典：研究課題「単球走化活性化因子の免疫学的測定法の確立とその臨床的意義の検討」課題番号04671430（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-04671430/046714301993kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

がん細胞選択的発現ベクターによる、ケモカイン遺伝子治療法の基礎的検討

金沢大学がん進展制御研究所従来の研究成果から、単球走化因子(MCP-1)遺伝子導入したがん細胞株の腫瘍形成能・転移能が低下することが明らかになっている。本年度は、MCP-1による遺伝子治療法の基礎的検討のために、(1)腫瘍免疫成立過程でのMCP-1の役割(2)自殺遺伝子併用によるMCP-1遺伝子治療法によるがん退縮効果の機序を検討した。その結果、(1)IL-4遺伝子導入colon 26細胞の腫瘍拒絶過程において、IL-4遺伝子導入株を接種したマウスの所属リンパ節では、MCP-1の発現が誘導される結果、抗原提示能を有するMCP-1レセプターを保有する樹状細胞が所属リンパ節へと動員され、腫瘍が効果的に拒絶されることを示唆する結果を得られた。(2)CAGプロモーター下流にチミディン・キナーゼ(tk)遺伝子とMCP-1遺伝子とを、IRES配列をはさんだ形で並列して連結させたアデノウイルスベクターを作成した。tkを単独で発現させるアデノウイルスベクターに比べて、今回作成したベクターによるtkの発現量は同程度であった。しかし、MCP-1産生量は、MCP-1遺伝子単独発現ベクターに比較して、今回作成したベクターは約1/10程度であった。しかし、ヒト肝がん細胞株を接種したヌードマウスの腫瘍内に、このベクターを接種して、ガンシクロビールを全身投与すると、腫瘍壊死因子の産生を伴い、マクロファージ依存性に、腫瘍が完全に退縮することが認められた。したがって、MCP-1を用いた遺伝子治療法の場合には、発現されるMCP-1量が低くても、標的細胞の動員・活性化を引き起こすことができる可能性があると考えられた。さらに、細胞膜に発現するMCP-1キメラ蛋白を発現するアデノウイルスベクターを開発し、このベクターの投与によって、細胞膜に生物活性を保有するMCP-1が発現していることを確認した。研究課題/領域番号:14030030, 研究期間(年度):2002出典：「がん細胞選択的発現ベクターによる、ケモカイン遺伝子治療法の基礎的検討」研究成果報告書　課題番号14030030（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-14030030/)を加工して作

活性酸素によるインターロイキン8産生誘導機構の分子生物学的解析

金沢大学がん研究所リポ多糖類刺激によって、THP.1細胞でIL-8遺伝子が活性化されるが、この遺伝子発現にはNF-kBの活性化が必須であった。この系に、種々の抗酸化剤を添加したが、明らかな遺伝子発現抑制効果を示さなかった。これは用いた抗酸化剤の細胞への透過性などに問題がある可能性があると考え、この点を克服するために、リポ多糖類依存性にNF-kBの活性化を無細胞系で検討する系を確立した。この系では、NF-kBの活性化に先立ち、その細胞内阻害因子であるIkBのリン酸化が起きる一方で、IkBの分解は起きなかった。また、NF-kBの活性化にはスタウロスポリン感受性リン酸化酵素とチロシン・リン酸化酵素が関与するのに対して、IkBのリン酸化にはチロシン・リン酸化酵素が関与していた。さらに、粗精製したIkBリン酸化酵素は、リポ多糖類依存性に、IkBのC末端側に存在する、酸性アミノ酸に富む部分に存在するセリン・スレオニン残基、なかでもSer293をリン酸化した。さらに、このリン酸化酵素は、カゼイン・キナーゼやMAPKのペプチド性の阻害剤にては阻害されないことから、これらのリン酸化酵素とは基質特異性が異なった。リン酸化部位に相当するペプチドによって、無細胞系で認められるIkBのリン酸化・NF-kBの活性化がともに阻害されることから、この部位のリン酸化がこれらの現象に必須であることが明らかとなった。IL-8遺伝子転写を抑制するFK506・糖質ステロイド・インターフェロンの作用機序についても分子生物学的に解析した。これらの薬剤は、NF-kBの活性化を抑制することによって、IL-8遺伝子発現を抑制することが明らかになった。以上の結果は、NF-kBの活性化を抑制することが、急性炎症反応で大きな役割を果たしているIL-8産生抑制、ひいては急性炎症反応の制御にもつながる可能性を強く示唆している。First, we investigated the roles of reactive oxygen species in interleukin-8 (IL-8) gene activation by adding several anti-oxidants to human monocytic cell line, THP-1 stimulated with lipopolysaccahride (LPS). The activation of a transcription factor, NF-kappaB,was indispensable for LPS-induced IL-8 gene activation in THP-1 cells, as observed on other types of cells. However, when we added anti-oxidants to intact cells, we failed to observe any inhibition on IL-8 gene activation as well as NF-kappaB activation.We postulated that low-permeability of these anti-oxidants might account for their failure to inhibit IL-8 gene activation. Thus, by using cell extracts from THP-1 cells, we developed a cell-free system where NF-kappaB can be detected. In this system, we can add various types of inhibitors without considering their permeability or potential toxicity. Using this system, we observed that IkappaBalpha, an inhibitor of NF-kappaB,was phosphorylated before NF-kappaB activation. Moreover, the subsequent degradation of IkappaBalpha was not observed in this system. Furthermore, two distinct types of protein kinases, staurosporine-sensitive one (s) and tyrosine kinase (s), were involved in NF-kappaB activation whereas tyrosine kinase inhibitors but not staurosporine inhibited the phosphorylation of IkappaBalpha.In order to clarify the mechanism of NF-kappaB activation, we tried to characterize the IkappaBalpha phosphorylase. In response to LPS,partially purified IkappaBalpha kinase rapidly phosphorylated serine and threonine residues present in the carboxy-terminal acidic region of IkappaBalpha, particularly, Ser293. The peptide corresponding to this region inhibited NF-kappaB activation as well as IkappaBalpha phosphorylation in a cell-free system, indicating that the phosphorylation of this site is indispensable for these processes. Collectively, these results suggest the mechanisms of LPS-induced IL-8 gene activation as follows :LPS activates two types of kinases, tyrosine kinase (s) and staurosporine-sensitive one (s). Activated tyrosine kinase activates IkappaBalpha kinase, which in turn phosphorylates mainly serine residues present in the carboxy-terminal acidic region of IkappaBalpha. NF-kappaB dissociate from phosphoryalted IkappaBalpha, thereby translocating into nucleus and binding the corresponding cis-element. Staurosporine-sensitive kinase (s) may participate in NF-kappaB activation by phosphorylating the components of NF-kappaB.In paralled with these experiments, we also analyzed the molecular mechanisms of IL-8 gene repression by several agents such as FK506, a glucocorticoid, and interferon alpha/beta. We observed that these agents attenuated the NF-kappaB activation although the mechanisms were slightly different from each agent. These results raised the possibilities that the drug targeting NF-kappaB activation may be a good candidate for an anti-inflammatory agent by inhibiting the production of a potent neutrophil chemotactic cytokine, IL-8. Furthermore, our cell-free system to detect NF-kappaB activation will be useful for screening this kind of agents.研究課題/領域番号:06670346, 研究期間(年度):1994 – 1995出典：研究課題「活性酸素によるインターロイキン8産生誘導機構の分子生物学的解析」課題番号06670346（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-06670346/066703461995kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

ケモカインならびにそのレセプターの病態生理学的役割の解析を通した抗炎症剤の開発

本研究を通して、以下の研究成果を挙げた。1)マウス・メスの排卵直後に膣局所で産生されるインターロイキン8(IL-8)ホモログが、性周期依存的に起きる好中球の膣粘膜への浸潤を制御していることを明らかにした。 2)モノクロタリン投与による実験的肺高血圧モデルで、肺局所で産生される単球走化因子(MCP-1)が、肺へのマクロファージ浸潤とそれに引き続く肺の組織障害を制御している事を明らかにした。 3)IgA腎症で、急性型では尿中IL-8が上昇するのに対して、腎不全に移行しやすい慢性型では尿中MCP-1濃度の上昇がIL-8に比べて顕著であるなど、病型によって腎局所でケモカインが選択的に産生される可能性を認めた。 3)半月板形成性腎炎では、腎臓内で産生されるmacrophage inflammatory protein-1α(MIP-1α)が半月板形成に関与するのに対して、MCP-1が間質病変の成立に関与していることを示唆する結果を得た。 4)IL-8遺伝子を導入した癌細胞株を接種すると、接種部位での血管新生とともに腫瘍形成が亢進する事から、IL-8の血管新生作用を確認した。腫瘍の壊死部の近傍でIL-8蛋白・mRNAの発現が認められた。壊死部の近傍は低酸素状態であると考えられるので、種々のがん細胞株を低酸素状態に暴露したところ、IL-8遺伝子の転写ならびに産生が誘導された。さらに胃癌組織中の癌細胞そのものが、IL-8レセプターを発現していることも明らかになった。 5)活性化補体第5成分(C5a)刺激によって、単球細胞株でNF-κBならびにAP-1が活性化されることによって、IL-8遺伝子転写ならびに蛋白産生が誘導されることが明らかになった。 6)急性肝障害モデルで、インターフェロンγの組織障害への関与を明らかにした。This study was performed to clarify the pathophysiological roles of chemokines and their receptors in various types of diseases. Through these studies, we obtained the results as follows.1) Macrophage inflammatory protein (MIP)-2, a functional homologue of human interleukin-8 (IL-8), was produced periodically at mouse vaginal epithelium immediately after the ovulation. Moreover, locally produced MIP-2 was involved in postovulatory neutrophil migration into vagina.2) Subcutaneous injection of monocrotaline into rats caused chronic pulmonary hypertension accompanied with intrapulmonary macrophage infiltration. Monocyte chemoattractant protein (MCP)-1 was produced at the onset of macrophage infiltration. The administration of anti-MCP-1 antibodies reduced macrophage infiltration and alleviated pulmonary hypertension. These results suggest that MCP-1 was involved in the pathogenesis of monocrotaline-induced pulmonary hypertension, through inducing macrophage infiltration.3) In an acute typ e of IgA nephropathy, urinary IL-8 levels were increased with no increase in urinary MCP-1 levels. In contrast, in a chronic type of IgA nephropathy which is prone to develop chronic renal failure, urinary MCP-1 levels were markedly increased while urinary IL-8 levels were not. Moreover, we found that urinary MIP-lα and MCP-1 levels correlated with crescent formation and interstitial lesions in chronic crescentic glomerulonephritis, respectively. Thus, various chemokines were produced locally and differentially at the diseased kidney, thereby contributing to the establishment of various renal lesions.4) Angiogenesis and tumor formation was enhanced by IL-8 cDNA transfection into gastric cancer cell lines. Moreover, we observed IL-8 mRNA and protein expression near necrotic areas in the tumor sites. Because the area close to necrosis is presumed to be hypoxic, we rendered human ovarian cancer and melanoma cell lines hypoxia. Hypoxia activated two types of transcription factors, AP-1 and NF-κBB, thereby inducing IL-8 production. Furthermore, we obtained definitive evidence on the presence of IL-8 receptors on human gastric cancer cells. Collectively, these results suggest that IL-8 may be involved in tumor progression by inducing angiogenesis and changing the phenotypes of cancer cells.5) We observed that C5a activated AP-1 and NF-κB, thereby inducing IL-8 production in a human monocyte cell line.6) We obtained the evidence that interferon-γ was involved in granuloma formation in Propinibacterium acnes-primed mice and subsequent lipopolysaccharide-induced liver tissue damage, by regulating macrophage infiltration and the production of several cytokines including tumor necrosis factor (TNF)-α IL-12, and IL-18.研究課題/領域番号:10044254, 研究期間(年度):1998-1999出典：「ケモカインならびにそのレセプターの病態生理学的役割の解析を通した抗炎症剤の開発」研究成果報告書　課題番号10044254 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

Essential contribution of the CCL3-CCR5 axis to murine lung metastasis process

Division of Molecular Bioregulatio

ケモカインならびにレセプターの分析法の開発とその病態検査学的意義の検討

本研究を通して以下の研究成果を得た。1)マウス・メスの排卵後にIL-8の機能的ホモログであるマクロファージ炎症性蛋白(MIP)-2が、膣上皮で一過性に産生され、膣上皮への好中球浸潤を引き起すことを明らかにした。2)IgA腎症の急性型では尿中1L-8濃度が高く、尿中MCP-1濃度が検出感度以下であった。腎不全への移行が多い慢性型では、尿中MCP-1濃度が上昇しているのに対して、尿中IL-8濃\u27度の上昇は軽度であった。半月板形成性糸球体腎炎では、腎臓内で産生されるMIP-1αが半月板形成に、MCP-1が間質病変に関与していることを示唆する結果を得た。糖尿病腎症においては、間質のマクロファージがMCP-1陽性であり、尿中MCP-1濃度も上昇していた。3)IL-8遺伝子導入した癌細胞株を接種すると、血管新生と腫瘍形成が亢進した。癌病巣の低酸素状態の壊死近傍部位でIL-8蛋白・mRNAの発現が認められた。種々の癌細胞株を低酸素状態に暴露したところ、NF-κBとAP-1の2種類の転写因子が協調的に活性化され、IL-8遣伝子の転写が亢進していた。さらに、胃癌細胞株ではIL-8レセプターを発現していて、IL-8に反応して転移関連遺伝子の発現が誘導されていた。4)肝癌細胞株では、PEA3とAP-1とが協調的に恒常的に活性化されることによって、IL-8遺伝子転写が恒常的に起こっていた。C型肝炎ウイルス感染患者では、血清1L-8濃度のみが、慢性肝炎ならびに肝硬変患者に比べて、肝癌患者において上昇していた。さらにC型肝炎ウイルスのnonstructural protein(NS)5A蛋白遺伝子導入によって、IL-8遺伝子の転写と蛋白産生が誘導された。5)臍帯血中においてCD34陽性CCR1陰性細胞に赤芽球系の前駆細胞のほとんどが含まれることを明らかにした。1) A functional interleukin-8 (IL-8) homologue, macrophage inflammatory protein (MIP)-2, was produced by mouse vaginal epithelium, periodically after ovulation and caused neutrophil infiltration into vaginal epithelium.2) In acute type of IgA nephropathy, urinary IL-8 levels were increased with undetectable urinary monocyte chemoattractant protein (MCP)-1. In contrast, MCP-1 but not IL-8 levels were increased in urines from chronic type of IgA nephropathy patients. Moreover, crescentic glomerulonephritis, MIP-lα and MCP-1 produced in the kidney, were responsible for crescent formation and interstitial lesions, respectively. Furthermore, in diabetic nephropathy, macrophages in interstitium were positive for MCP-1 and urinary MCP-1 levels were increased.3) IL-8 protein and mRNA were detected near necrotic areas inside tumor tissues, where oxygen content is presumed to be low. The exposure of several types of cell lines to hypoxia activated two transcription factors, NF-_kB and AP-1, and eventually induced IL-8 gene transcription. Human gastric cancer cell lines transfected with IL-8 gene exhibited faster tumor formation with enhanced angiogenesis when injected into nude mice, compared with parental cells. Moreover, most of gastric cancer cell lines expressed IL-8 receptors and IL-8 induced the expression of metastasis-related genes in some gastric cancer cell lines.4) In hepatoma cell lines, two distinct transcription factors, PEA3 and AP-1, were constitutively activated, which resulted in constitutive IL-8 gene transcription. Among patients infected with human hepatitis C virus, serum IL-8 levels were increased in patients suffering from hepatoma, when compared with chronic hepatits and liver cirrhosis patients. Moreover, the transduction of nonstructural protein (NS) 5A of human hepatitis C virus induced IL-8 gene transcription as well as IL-8 protein secretion.5) In cord blood, CCR1 expression among CD34-positive cells, was restricted to erythroid progenitor cells.研究課題/領域番号:10557249, 研究期間(年度):1998-2001出典：「ケモカインならびにレセプターの分析法の開発とその病態検査学的意義の検討」研究成果報告書　課題番号10557249(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作