Identifikation und Genexpressionsanalyse disseminierter Tumorzellen des malignen Melanoms

Das maligne Melanom ist eine Krebserkrankung mit deutlich steigender Inzidenz. Das Auftreten von Lymphknotenmetastasen ist mit einer ungünstigen Prognose für den Patienten verbunden, sodass die Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten des metastasierten Melanoms von großer Bedeutung ist. Das Ziel dieser Arbeit war die Isolation und molekulare Charakterisierung gestreuter Tumorzellen beim malignen Melanom. Es wurden insgesamt 333 durch Immunfluo-reszenz markierte MCSP-positive Zellen aus den Wächterlymphknoten von 102 Patienten mit malignem Melanom isoliert. Eine Färbung gegen das intrazelluläre Antigen gp100 (Antikörper HMB-45) wurde, wenn möglich, parallel durchgeführt. Gleichzeitig wurde an diesen Wächterlymphknoten die Routinediagnostik in der Abteilung für Pa-thologie durchgeführt. Bei Vergleichen der unterschiedlichen Aufarbeitungsmetho-denmethoden zeigte sich, dass durch die MCSP- (62,7 %) und die HMB-45-Färbung (45,2 %) häufiger malignomsuspekte Zellen nachgewiesen werden konnten, als durch die Routinediagnostik (25,5 %). Aufgrund dieser Diskrepanz stellte sich die Frage, ob alle MCSP- und HMB-45-positiven Zellen malignen Ursprungs waren. Weiterhin wurde das Auftreten MCSP-positiver Zellen auch in Kontrolllymphknoten gesunder Spender beschrieben. Zur Klärung der Malignität MCSP-positiver Zellen schlossen sich weitere moilekulare Analysen dieser Zellen an. Bei HMB-45-positiven Zellen waren genomische Aberrationen bereits in vorausgegangenen Studien nachgewiesen worden. MCSP-positive Zellen unterschieden sich morphologisch in ihrer Größe. Große Zellen traten in 16 Lymphknoten (15,7 %) auf und waren assoziiert mit einem hohen DCCD sowie mit einem positiven Ergebnis der HMB-45-Färbung und der Routinediagnostik. Des Weiteren bestand ein signifikanter Zusammenhang der Tumordicke nach Breslow mit dem Auftreten großer Zellen und mit einem fortgeschrittenen Patientenalter. Kleine Zellen traten in 48 der untersuchten Lymphknoten (47,1 %) auf und gingen häufig mit einem geringen DCCD und einem negativen Ergebnis der Routinediagnostik einher. Um die Bedeutung MCSP-positiver Zellen zu klären wurden PCR-basierte Analysen des Transkriptoms dieser Zellen durchgeführt. Hierfür wurde die mRNA der isolierten Einzelzellen extrahiert, was bei 126 der 333 Zellen erfolgreich durchgeführt werden konnte. Zur Charakterisierung der Zellen dienten ausgewählte, mit Zellen des malig-nen Melanoms assoziierte Markergene für ausdifferenzierte Melanomzellen (HMB-45, Melan-A, S100B, MCSP, TRP2) sowie für melanozytäre Stammzellen (ABCB5, Nestin, Jarid1B, CD271), deren Expression mittels PCR getestet wurde. Signifikant mehr große (86,7 %) als kleine (62,1 %) MCSP-positive Zellen exprimierten mindes-tens ein Markergen. Weiterhin exprimierten große Zellen häufiger mehrere Marker-gene gleichzeitig. Die Markergene HMB-45, Melan-A, S100B, TRP2, Nestin und CD271 wurden signifikant häufiger von großen Zellen gebildet. Kein signifikanter Un-terschied zeigte sich in der Expression von MCSP, ABCB5 und Jarid1B. Das einzige Markergen, das häufiger von kleinen als von großen Zellen gebildet wurde war ABCB5. Es ist bekannt, dass MCSP-positive Zellen auch ohne malignen Hintergrund in Lymphknoten gesunder Probanden auftreten. Hierdurch ist auch die deutlich höhere Anzahl MCSP-positiver Lymphknoten im Gegensatz zum Nachweis einer Lymphkno-tenbeteiligung der malignen Erkrankung in der Routinediagnostik erklärbar. Um nicht-maligne MCSP-positive Zellen herauszufiltern wurden Kriterien definiert, um diese Zellen auszuschließen. Eine große Zellform zeigte einen Zusammenhang mit einem hohen DCCDMCSP, einem positiven Ergebnis in der Routinediagnostik sowie einer hohen Anzahl gleichzeitig exprimierter Markergene. Aus diesem Grund wurde eine große Zellform als Kriterium für gestreute Tumorzellen gewählt. Weiterhin zeigte sich ein Zusammenhang kleiner Differenzierungsmarkergen-positiver Zellen mit einem höheren DCCDMCSP und mit einer höheren Expressionsrate von Stammzellmarker-genen als bei kleinen Differenzierungsmarkergen-negativen Zellen, sodass kleine Differenzierungsmarkergen-negativen Zellen als nicht-maligne eingestuft wurden. Die alleinige Expression des Markers S100B, der nicht spezifisch für melanozytäre Zellen ist, wurde als weiteres Ausschlusskriterium gewählt. Ausgeschlossen wurden von den 126 MCSP-positiven Zellen also kleine MCSP-positive Zellen, die kein Markergen oder als einziges Markergen S100B exprimierten. Nach Anwendung dieser Ausschlusskriterien wurden schließlich 87 MCSP-positive Zellen aus 36 Lymphknoten als maligne eingestuft. Nun zeigte sich auch ein signifi-kanter Zusammenhang von positiven Ergebnissen in MCSP-Färbung und Routinedi-agnostik. Außerdem glichen sich die zuvor signifikanten Unterschiede der Marker-genexpression zwischen kleinen und großen MCSP-positiven Zellen an. Es bestanden weiterhin signifikante Unterschiede in der Expression von Melan-A, S100B und Nestin. In der Expression der Stammzellmarkergene bestand kein Unterschied mehr zwischen beiden Zellgruppen. Die Ergebnisse unserer Analysen weisen auf eine dynamische und heterogene Ent-wicklung gestreuter Tumorzellen bei der Bildung von Lymphknotenmetastasen hin. Sowohl unter den großen als auch unter den kleinen MCSP-positiven Zellen befinden sich Melanomzellen. Das Auftreten einzelner MCSP-positiver Zellen ist jedoch nicht zwingend mit der Bildung von Lymphknotenmetastasen verbunden. Großen MCSP-positiven Zellen, die in Zusammenhang mit einem hohen DCCD, einem positiven Er-gebnis der Routinediagnostik sowie einer größeren Tumordicke nach Breslow auftreten, kommt eine entscheidende Bedeutung bei der Bildung von Metastasen zu. Kleine MCSP-positive Zellen sind möglicherweise als Vorstufe großer Zellen zu sehen, die sich noch im Prozess der Entwicklung befinden. Die weitere Analyse der in den Lymphknoten gestreuten Tumorzellen, mit besonde-rem Augenmerk auf die großen MCSP-positiven Zellen, kann neue Ansatzpunkte für die systemische Therapie beim metastasierten Melanom liefern