УСЛОВИЯ ЭФФЕКТИВНОГО ПОДАВЛЕНИЯ ПЦР С ПОМОЩЬЮ LNA-ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ПРОСТОЙ И ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ДЕТЕКЦИИ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ

PCR clamping/wild-type blocking PCR with non-extendable locked nucleic acid (LNA) oligonucleotides is used for sensitive detection of somatic mutations in tumors. Various  versions of the technique use different DNA polymerases and LNA oligonucleotides with and  without additional phosphorothioate modifications. Here we studied requirements for successful  PCR clamping with LNA oligonucleotides and Taq DNA polymerase for analysis of mutations in  KRAS and BRAF genes by means of real-time PCR and Sanger sequencing. We found that  addition of phosphorothioate linkages at the 5’-end of LNA oligonucleotide to protect from 5’- exonuclease activity of Taq DNA polymerase did not improve clamping. For most target  sequences, efficient clamping was observed at melting temperature of LNA oligonucleotide  20‑25°C above annealing/extension temperature of the PCR with a 2-step protocol. Under such  conditions, simple and sensitive detection of mutations in KRAS and BRAF genes was feasible using real-time PCR with TaqMan probes or Sanger sequencing.Специфическое блокирование амплификации аллеля дикого типа в ПЦР с помощью олигонуклеотидов, модифицированных по остатку рибозы (закрытые нуклеиновые кислоты, locked nucleic acids, LNA), используется для высокочувствительной детекции соматических мутаций в опухолях. Описаны различные версии метода анализа мутаций с использованием LNA-олигонуклеотидов как с дополнительной модификацией фосфотиоатными группами, так и без таких групп, при этом использовались  различные ДНК полимеразы. В работе проведен анализ оптимальных условий для успешного специфического блокирования ПЦР с помощью LNA-олигонуклеотидов при анализе мутаций в генах KRAS и  BRAF. Мы обнаружили, что фосфотиоатная защита на 5’-конце олигонуклеотидов не влияет на эффективность блокирования аллеля дикого типа. Выявлено, что для большинства последовательностей  эффективное блокирование наблюдается при проведении шага отжига и элонгации ПЦР при температуре на  20–25°С ниже температуры плавления LNA-олигонуклеотида. При таких условиях реакции возможна простая и высокочувствительная детекция мутаций в генах KRAS и BRAF с использованием как секвенирования по Сэнгеру, так и ПЦР в реальном времени с Taqman зондами

СПЕКТР МУТАЦИЙ ГЕНА BRCA1 У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В МОЛОДОМ ВОЗРАСТЕ В РОССИИ

Aim of the study. Aim of the study was to estimate the occurrence of pathogenic mutations in the BRCA1 gene in Russian breast cancer patients.Material and methods. Complete coding sequence of the BRCA1 gene of 445 early onset  breast cancer patients (under 40 years) from Novosibirsk region (Russia) were analyzed by  targeted Next Generation Sequencing (NGS) using Ion Torrent platform. Results. Forty (9%) carriers of various pathogenic mutations were revealed. Thirty five (7,9%) patients  carried 5382insC mutation, described earlier as a founder mutation for Slavic population.  Five (1.1%) patients carried various pathogenic mutations, namely C61G, 462delCC, E143X,  4153delA, and IVS18+1G>T. Besides, 29 genetic variants with no clinical significance or with  unknown clinical significance were detected in BRCA1 gene among 445 early onset breast  cancer patients. Conclusions. Data on the frequency of genetic variations in the BRCA1 gene among early onset breast cancer patients in the Novosibirsk Region (Russia) were  obtained. Proportion of the 5382insC mutation is 87.5% of all pathogenic mutations in the BRCA1 gene found in patients.Цель исследования – оценить частоту встречаемости патогенных мутаций в BRCA1 гене у женщин с раком молочной железы, проживающих в России.Материал и методы. Проведён анализ полной кодирующей части гена BRCA1 у 445 больных раком молочной  железы на ранней стадии (возраст больных до 40 лет), проживающих в Новосибирской области (Россия), с  помощью метода таргетного секвенирования на платформе Ion Torrent. Результаты. Выявлено 40 (9 %)  носительниц различных патогенных мутаций. У 35 (7,9 %) пациенток обнаружена мутация 5382insC, описанная  ранее как «мутация-основателя» в славянской популяции. У 5 (1,1 %) пациенток были выявлены  другие различные патогенные мутации, а именно C61G, 462delCC, E143X, 4153delA и IVS18 + 1G> T. Кроме  того, 29 генетических вариантов с отсутствующей или неясной клинической значимостью были обнаружены в  гене BRCA1 у 445 больных раком молочной железы на ранней стадии. Выводы. Получены данные о частоте  генетических вариаций гена BRCA1 у больных раком молочной железы на ранней стадии, проживающих в  Новосибирской области (Россия). Доля мутации 5382insC составляет 87,5 % от всех патогенных мутаций в гене BRCA1, обнаруженных у пациенток

Large family with both parents affected by distinct BRCA1 mutations: implications for genetic testing

Although the probability of both parents being affected by BRCA1 mutations is not negligible, such families have not been systematically described in the literature. Here we present a large breast-ovarian cancer family, where 3 sisters and 1 half-sister inherited maternal BRCA1 5382insC mutation while the remaining 2 sisters carried paternal BRCA1 1629delC allele. No BRCA1 homozygous mutations has been detected, that is consistent with the data on lethality of BRCA1 knockout mice. This report exemplifies that the identification of a single cancer-predisposing mutation within the index patient may not be sufficient in some circumstances. Ideally, all family members affected by breast or ovarian tumor disease have to be subjected to the DNA testing, and failure to detect the mutation in any of them calls for the search of the second cancer-associated allele

REQUIREMENTS FOR EFFICIENT PCR CLAMPING BY LOCKED NUCLEIC ACID OLIGONUCLEOTIES FOR SIMPLE AND SENSITIVE DETECTION OF SOMATIC MUTATIONS

PCR clamping/wild-type blocking PCR with non-extendable locked nucleic acid (LNA) oligonucleotides is used for sensitive detection of somatic mutations in tumors. Various  versions of the technique use different DNA polymerases and LNA oligonucleotides with and  without additional phosphorothioate modifications. Here we studied requirements for successful  PCR clamping with LNA oligonucleotides and Taq DNA polymerase for analysis of mutations in  KRAS and BRAF genes by means of real-time PCR and Sanger sequencing. We found that  addition of phosphorothioate linkages at the 5’-end of LNA oligonucleotide to protect from 5’- exonuclease activity of Taq DNA polymerase did not improve clamping. For most target  sequences, efficient clamping was observed at melting temperature of LNA oligonucleotide  20‑25°C above annealing/extension temperature of the PCR with a 2-step protocol. Under such  conditions, simple and sensitive detection of mutations in KRAS and BRAF genes was feasible using real-time PCR with TaqMan probes or Sanger sequencing

The spectrum of BRCA1 gene mutations in early onset breast cancer patients from Russia

Aim of the study. Aim of the study was to estimate the occurrence of pathogenic mutations in the BRCA1 gene in Russian breast cancer patients.Material and methods. Complete coding sequence of the BRCA1 gene of 445 early onset  breast cancer patients (under 40 years) from Novosibirsk region (Russia) were analyzed by  targeted Next Generation Sequencing (NGS) using Ion Torrent platform. Results. Forty (9%) carriers of various pathogenic mutations were revealed. Thirty five (7,9%) patients  carried 5382insC mutation, described earlier as a founder mutation for Slavic population.  Five (1.1%) patients carried various pathogenic mutations, namely C61G, 462delCC, E143X,  4153delA, and IVS18+1G>T. Besides, 29 genetic variants with no clinical significance or with  unknown clinical significance were detected in BRCA1 gene among 445 early onset breast  cancer patients. Conclusions. Data on the frequency of genetic variations in the BRCA1 gene among early onset breast cancer patients in the Novosibirsk Region (Russia) were  obtained. Proportion of the 5382insC mutation is 87.5% of all pathogenic mutations in the BRCA1 gene found in patients