Biliary Epithelial Apoptosis, Autophagy, and Senescence in Primary Biliary Cirrhosis

Primary biliary cirrhosis (PBC) is a chronic cholestatic liver disease characterized serologically by the high prevalence of anti-mitochondrial autoantibodies (AMAs) and histologically by the cholangitis of small bile ducts, eventually followed by extensive loss of the small bile duct. An autoimmune pathogenesis is suggested by clinical and experimental studies, but there remain issues regarding the etiology, the significance of AMAs in the pathogenesis of bile duct lesions, and so on. The unique properties of apoptosis in biliary epithelial cells (BECs), in which there is exposure of autoantigen to the effectors of the immune system, are proposed to be a cause of bile duct lesions in PBC. Recent progress disclosed that cellular senescence and autophagy are involved in bile duct lesions in PBC. Senescent BECs may modulate the periductal microenvironment by expressing senescence-associated secretory phenotypes, including various chemokines, and contribute to the pathogenesis of bile duct lesions in PBC

Novel Approach to Bile Duct Damage in Primary Biliary Cirrhosis: Participation of Cellular Senescence and Autophagy

Primary biliary cirrhosis (PBC) is characterized by antimitochondrial autoantibodies (AMAs) in patients' sera and histologically by chronic nonsuppurative destructive cholangitis in small bile ducts, eventually followed by extensive bile duct loss and biliary cirrhosis. The autoimmune-mediated pathogenesis of bile duct lesions, including the significance of AMAs, triggers of the autoimmune process, and so on remain unclear. We have reported that cellular senescence in biliary epithelial cells (BECs) may be involved in bile duct lesions and that autophagy may precede the process of biliary epithelial senescence in PBC. Interestingly, BECs in damaged bile ducts show characteristicsof cellular senescence and autophagy in PBC. A suspected causative factor of biliary epithelial senescence is oxidative stress. Furthermore, senescent BECs may modulate the microenvironment around bile ducts by expressing various chemokines and cytokines called senescence-associated secretory phenotypes and contribute to the pathogenesis in PBC

肝内結石症に合併する肝内胆管癌の発生の進展に関する免疫組織化学的検討

金沢大学医学部1.材料と方法:肝内結石症46例,内訳は,肝内胆管癌合併症16例,前癌性病変合併例15例,癌や前癌性病変非合併例15例.11例の正常剖検肝を対照として用いた.ホルマリン固定パラフィン包理切片上で,免疫組織化学(StreptABC法)を行った.今回は,乳腺型ムチンコア蛋白(モノクローナル抗体DF3を使用),粘液糖蛋白関連糖鎖としてシリアルTn,Tn,T抗原(Dako社)の検討を行った.2.乳腺型ムチンコア蛋白の発現:肝内結石症に合併した肝内胆管癌では56%の症例で発現を認めた.前癌性病変では27%の症例で部分的に発現を認めた.非合併例の胆内胆管では,47%k症例で,ごく一部に弱い発現を認めた.また,対照正常肝では,9%の症例で肝内肝管のごく一部に発現を認めた.乳腺型ムチンコア蛋白の発現局在は,細胞膜や胞体内びまん性の発現を22%の癌症例で認めたが,その他の癌,前癌性病変,肝内胆管における発現は全て,管腔縁に限局していた.3.シリアルTn,Tn,T抗原の発現:肝内胆管癌では,それぞれの発現は91%,100%,73%と高率で,管腔縁や胞体内びまん性の発現を認めた.同様の発現は,前癌性病変では,29%,33%,5%,非合併例の肝内胆管では,7%,0%,14%であった.4.今後の研究の展開:肝内結石症に合併した肝内胆管癌では,乳腺型ムチンコア蛋白の発現が,通常の肝内胆管癌(発現率96%)よりやや低いことが明らかとなった.これらの症例では,他の型のムチンコア蛋白が発現されている可能性も考えられ,今後,他の型のムチンコア蛋白を認識するモノクローナル抗体を入手し,さらに検討したい.尚,シアリルルイスX,ルイスX,ルイスY抗原の発現は現在検討中である.研究課題/領域番号:05770118, 研究期間(年度):1993出典：研究課題「肝内結石症に合併する肝内胆管癌の発生の進展に関する免疫組織化学的検討」課題番号05770118（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-05770118/）を加工して作

増生細胆管でのアポムチンサブタイプの発現とその意義: 増生細胆管は肝ステムセルか？

金沢大学医薬保健研究域医学系1.正常肝内胆管系におけるアポムチンの発現分布正常肝(組織学的)35例を用いて、免疫細織学的に肝内大型、隔壁、小葉間胆管および細胆管でのアポムチンサブタイプの蛋白レベルの発現を検討した。結果として、肝内大型胆管ではMUC3アポムチンが、隔壁、小葉間胆管および細胆管ではMUC6アポムチンが生理学的に分布する事がわかった。また、In situ hybridization法を用いたアポムチンmRNAの検討では、MUC3、MUC6の蛋白レベルと一致した発現とMUC1mRNAの肝内大型・隔壁胆管での発現を認めた。2.慢性肝疾患の増生細胆管におけるアポムチンの発現の変動ウイルス性慢性肝炎47例と原発性胆汁性肝硬変(PBC)28例で、アポムチンサブタイプの蛋白とmRNAレベルの発現を検討した。結果として、ウイルス性慢性肝炎では小型胆管や細胆管におけるMUC6アポムチン発現は蛋白、mRNAともに増加し、その程度は肝炎の活動性に比例していた。一方、PBCでは小型胆管での発現は増加するものの細胆管での発現は軽度で、両疾患の増生細胆管に質的な差異があることが示唆された。3.末梢型肝内胆管癌、肝硬変合併肝内胆管癌、混合型昆肝癌におけるアポムチンの発現小型胆管が発生母地と考えられるこれらの癌について、それぞれ10例,4例,16例でアポムチンサブタイプの蛋白とmRNAレベルの発現を検討した。結果として、肝硬変合併肝内胆管癌と混合型肝癌は共通して高率のMUC1とMUC6アポムチン発現を示していた。以上の結果より、肝硬変合併肝内胆管癌と混合型肝癌はMUC6アポムチン発現が明瞭な増生細胆管より発生する可能性が示唆された。研究課題/領域番号:09770116, 研究期間(年度):1997 – 1998出典：「増生細胆管でのアポムチンサブタイプの発現とその意義：増生細胆管は肝ステムセルか？」研究成果報告書　課題番号09770116（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-09770116/)を加工して作

胆汁中粘液糖蛋白の解析: 肝内胆管病変との対比を中心に

金沢大学医学部1.胆汁中粘液糖蛋白のウエスタンブロッテイング:肝内結石症9例,総胆管結石や胆管癌,膵癌等による閉塞性黄疸症例37例のPTCD胆汁を収集し,ウエスタンブロッテイング(ABC法)で,ABH血液型物質,Lewis血液型関連物質(a,b,x,y),sialyl-Tn,Tn,T坑原,及びCarcinoembryonic antigen(CEA)の検出を試みた.この結果,CEAとLewis Xが肝内結石症の粘液糖蛋白と糖蛋白に高率に検出され,肝内結石症の症態形成との関連性が示唆された.また,sialyl-Tn坑原は,肝内胆管癌,総胆管癌,膵癌にのみ高率に検出され,癌の早期診断への応用も期待された.その他の血液型物質等は,特に疾患特異性を示さなかった.2.肝内胆管における粘液糖蛋白の免疫組織化学的検討:肝内結石症46例(癌合併16例,異型上皮合併15例,非合併15例)正常剖検肝11例の肝門部大型胆管を含む組織切片を収集し,胆汁中粘液糖蛋白の解析で変動がみられたCEA,Lewis Xの発現を検討した.この結果,正常大型胆管では殆ど発現がみられないCEA,Lewis Xが,肝内結石症では,癌や異型上皮以外の箇所にも高率に陽性で,特に結石周囲でより強く認められた.CEAの発現は大型胆管上皮,Lewis Xは胆管付属腺(壁内腺)に局在しており,胆汁中のCEA,Lewis Xはこれらの胆管壁成分より分泌されると考えられた.閉塞性黄疸症例胆管壁におけるCEA,Lewis Xの発現は現在検討中である.3.今後の研究の展開:今回の検討より,胆汁中粘液糖蛋白は肝内結石症や胆管癌等で特異的な変動を示すことが明らかになった.今後,さらに,胆汁中の他の糖鎖,糖蛋白を,レクチンブロッテイング法も加えて検討して行きたい.研究課題/領域番号:06857017, 研究期間(年度):1994出典：研究課題「胆汁中粘液糖蛋白の解析:肝内胆管病変との対比を中心に」課題番号06857017（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-06857017/）を加工して作

原発性胆汁性肝硬変(PBC)における胆管消失の分子機構 胆管消失は再生不良によるか?

金沢大学医学系研究科形態機能病理学総

肝内胆管消失症候群における胆管再生・修復不全の分子機構の解析

肝内胆管消失症候群における胆管再生・修復機構を解析する目的で、原発性胆汁性肝硬変(PBC)を含む肝内胆管消失症候群45例と対照疾患肝43例,正常肝22例の人体材料を用いて免疫組織化学的に、肝内胆管上皮における粘膜再生因子TFF1〜3とTFF2受容体候補分子DMBT1,肝細胞増殖因子(HGF)関連因子(HGFA,HAI-1,cMET)の発現と胆管細胞老化について検討した。肝内胆管系では胆管レベルと胆管障害に応じた特徴的なTFF1〜3,DMBT1発現がみちれ,大型胆管では主にTFF1,3/DMBT1が,小型胆管では主にTFF2/DMBT1が粘膜防御に働くことが示唆された。特にPBCでは胆管障害部を中心にTFF2とDMBT1発現の亢進が見られた。HGF関連分子では、PBCの胆管障害部に特徴的にHAI-1発現亢進が見られた。さらに組織化学的検討と細胞老化関連p21^,p16^,p16^抑制因子Bmi1発現の検討から、移植後慢性拒絶肝の肝内胆管とPBCの肝内小型胆管障害部には高率にp21^,p16^の発現亢進を伴う胆管細胞の老化がみられることが明らかとなった。RT-PCR法を用いた肝組織中mRNA発現の検討の結果も蛋白発現の検討結果とほぼ一致した。 マウス培養胆管細胞を用いた検討では、TNF-αなどのサイトカイン添加や酸化ストレスによりTFF1〜3とDMBT1,HGF関連因子HAI-1の発現亢進が見られた。また、酸化ストレスは培養マウス胆管細胞に細胞老化を誘導すること、この時、p16^抑制因子Bmi1発現低下と細胞老化関連p21^,p16^の発現亢進が見られることが明らかとなった。The impaired regeneration of biliary mucosa may be related to the pathogenesis of bile duct loss in vanishing bile duct syndrome. We examined immunohistochemically the expression of trefoil factor family (TFF)-1,2,3, a putative receptor for TFF2:DMBT1, hepatocytes growth factor (HGF) related factors (HGFA,HAI-1,cMET) and the involvement of cellular senescence in intrahepatic bile ducts in the livers taken form the patients with vanishing bile duct syndrome (n=45) including primary biliary cirrhosis (PBC) and control livers (n=65). In intrahepatic biliary system, the site-characteristic distribution of TFF1-3 was seen and TFF1, 3 and TFF2 play a role in the mucosal repair in large and small intrahepatic bile ducts, respectively. The expression of TFF2, DMBT1 and HAI-1 was increased in the damaged bile ducts in PBC. Furthermore, the biliary epithelial cells showed the features for cellular senescence such as the increased expression of p16^ and p21^ in the damaged bile ducts in PBC and in the livers of chronic allograft rejection. The decreased expression of bmi1, a represser of p16^ was involved in the cellular senescence of biliary epithelial cells. The mRNA expression of these factors was in accord with the protein expression detected by immunohistochemistry. The oxidative stress and several cytokines such as TNF-alpha increased the expression of TFFs and HAI-1 in cultured mouse biliary epithelial cells. In addition, oxidative stress decreased the expression of bmi1, increased the expression of p16^ and p21^ and induced cellular senescence in cultured mouse biliary epithelial cells. Taken together, TFF-1,2,3 and HGF related factors were involved in the mucosal repair system in the intrahepatic biliary system as well as in the gastrointestinal tracts. The cellular senescence of biliary epithelial cells may be a main cause for the impaired regeneration and following bile duct loss in vanishing bile duct syndrome.研究課題/領域番号:15590297, 研究期間(年度):2003–2005出典：「肝内胆管消失症候群における胆管再生・修復不全の分子機構の解析」研究成果報告書　課題番号15590297 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

ウイルス性肝硬変の再生結節内の“ルイスY抗原陰性巣":新しい癌関連病巣か

金沢大学医学部1.肝細胞癌,境界病変の背景肝における"ルイスY抗原陰性巣":肝細胞癌30例,境界病変2例のホルマリン固定パラフィン包埋切片を用い,免疫組織化学的にルイスY抗原の発現を検討した.肝細胞癌の内10例と境界病変2例の背景肝に,"ルイスY抗原陰性巣"の出現を認めた.この12例の背景肝はほぼ全例完成した肝硬変であった."ルイスY抗原陰性巣"は,肝硬変偽小葉の中心部に位置し,多発する傾向にあった."ルイスY抗原陰性巣"のサイズは種々であったが,いずれも結節状で膨張性の発育を示し,細胞密度はやや高い傾向にあった.肝細胞癌,境界病変では,肝細胞癌13例(43%)に部分的なルイスY抗原陽性を認めるのみであった.針生検材料(肝細胞癌10例,境界病変14例)の検討でも,肝細胞癌の3例(30%)でのみ,部分的にルイスY抗原陽性を見るのみで,境界病変は全例ルイスY抗原陰性であった.境界病変例の内,2例では,ルイスY抗原陰性の境界病変部が圧排性に発育していた.2."ルイスY抗原陰性巣"におけるKi-67抗原,p53蛋白発現:"ルイスY抗原陰性巣"の見られた肝細胞癌10例,境界病変2例で,免疫組織化学(マイクロウエーブ賦活)的に,増殖活性の指標であるKi-67抗原と,癌抑制遺伝子産物であるp53蛋白発現を検討した."ルイスY抗原陰性巣"では,Ki-67抗原発現は周囲よりやや高い傾向にあり,増殖活性の増加が示唆された.p53蛋白発現は“ルイスY抗原陰性巣"では全く見られなかった.尚,p53蛋白は,肝細胞癌では6例に陽性であったが,境界病変では全例陰性であった.3.まとめ:今回の検討より,"ルイスY抗原陰性巣"では,増殖活性が増加していること,p53蛋白発現はないことが明かとなった.この性質は境界病変と同様であり,癌関連病変あるいは前癌病変であると考えられた.研究課題/領域番号:07770124, 研究期間(年度):1995出典：研究課題「ウイルス性肝硬変の再生結節内の“ルイスY抗原陰性巣":新しい癌関連病巣か」課題番号07770124（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-07770124/）を加工して作

Lewis Y 抗原の新たな発現は障害肝内胆管における鋭敏な表現形質の変化である

取得学位：博士(医学)，報告番号：乙第1437号，学位授与年月日：平成7年5月17日,学位授与年：199

Autophagy May Precede Cellular Senescence of Bile Ductular Cells in Ductular Reaction in Primary Biliary Cirrhosis

Background and Aim: Recent studies disclosed that autophagy facilitates the process of senescence. Given that cellular senescence is involved in the pathophysiology of ductular reaction (DR) in primary biliary cirrhosis (PBC), we examined an involvement of autophagy in DRs in PBC and control livers. Methods: We examined immunohistochemically the expression of microtubule-associated proteins light chain 3β (LC3) as autophagy marker, p62/sequestosome-1 (p62) as autophagy-related marker in bile ductular cells in livers taken from the patients with PBC (n = 42), and control livers (n = 100). The expression of senescent markers (p16INK4a and p21WAF1/Cip1) in bile ductular cells and their correlation with autophagy was also evaluated. Results: The expression of LC3 was seen in coarse vesicles in the cytoplasm of bile ductular cells and significantly more frequently in PBC of both early and advanced stages when compared to control livers (p < 0.01). The expression of p62 was seen as intracytoplasmic aggregates and significantly more frequently in PBC when compared to control livers (p < 0.05). The expression of LC3 and p62 significantly correlated with each other (p < 0.01). The expression of LC3 and p62 significantly correlated with the expression of p16INK4a, p21WAF1/Cip1 (p < 0.05). Conclusions: Autophagy is frequently seen in bile ductular cells in DRs in PBC. Since cellular senescence of bile ductular cells is rather frequent in the advanced stage of PBC, autophagy may precede cellular senescence of bile ductular cells in DRs in PBC. © 2011 Springer Science+Business Media, LLC