Determinación de histamina y de la microbiota responsable en productos lácteos: potenciales soluciones para reducir su acumulación en quesos madurados

Las aminas biógenas (ABs) son compuestos generados por la descarboxilación de su aminoácido precursor. Entre las ABs más importantes se encuentran la histamina, la tiramina, la cadaverina y la putrescina. Su ingesta a elevadas concentraciones por la población en general o su consumo a bajas concentraciones en personas sensibles puede suponer un problema importante para la salud pública. Es por ello que es necesario emplear métodos sensibles para la detección de estos metabolitos en alimentos. Los productos lácteos, y en especial los quesos madurados, son uno de los alimentos habitualmente implicados en intoxicaciones por histamina, generada por microorganismos con actividad descarboxilasa, lo que alumbra la necesidad de identificar estos microorganismos.Los objetivos de esta Tesis Doctoral fueron evaluar la concentración de histamina en productos lácteos tras la puesta a punto de una técnica de análisis de ABs sensible; identificar los microorganismos responsables de la presencia de histamina en quesos comerciales; estudiar el patrón de distribución de la AB principal, la histamina, en diferentes áreas de quesos comerciales y evaluar su relación con la presencia de microorganismos productores y las características físicas y químicas y; ensayar posibles soluciones microbianas y enzimáticas que permitan reducir su acumulación en quesos de larga maduración.Inicialmente, se desarrolló un método para la determinación de cuatro ABs (histamina, tiramina, putrescina y cadaverina) en diferentes productos lácteos (leche, yogur y kéfir) basado en cromatografía líquida de alta eficacia de fase reversa (RP-HPLC) acoplado a un sistema de fluorescencia. Las ABs se extrajeron selectivamente mediante extracción en fase sólida (SPE) y posteriormente se derivatizaron con 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidilo carbamato (AQC). Se obtuvo un método con una elevada sensibilidad, con límites de detección de entre 0,12 y 0,2 mg/L. Este método fue aplicado en 37 muestras de leche, 23 de yogur, y 14 de kéfir dónde se pudo comprobar la variabilidad de ABs entre las muestras. Si bien la mayoría de las muestras de leche no superaron el límite de detección (LD), la frecuencia de aparición y la concentración de estos compuestos fue mayor en yogur y kéfir alcanzando valores de hasta 79 mg/kg de ABs totales en muestras de kéfir.Es conocido que los quesos madurados pueden contener cantidades elevadas de histamina. La microbiota presente en el queso es la responsable por la descarboxilación de su aminoácido precursor, la histidina, debido a la acción de la histidina descarboxilasa. Para conocer el origen de la histamina se llevó a cabo la identificación de los microorganismos responsables de su formación en quesos. En primer lugar, se analizó la concentración de histamina de 39 tipos diferentes de quesos comerciales, para después identificar los microorganismos responsables de su aparición. Como resultado, una tercera parte de los quesos analizados contenían más de 200 mg/kg de histamina y dos de ellos superaron los 500 mg/kg histamina. Se obtuvieron aislados microbianos de los cinco quesos con las concentraciones más altas de histamina y se analizó el material genético total de los quesos, con el fin de verificar la presencia del gen de la histidina descarboxilasa (hdc). Tras comprobar la presencia del gen hdc en dichas muestras, se amplificó la secuencia de nucleótidos del gen hdc, y se sometió a secuenciación Sanger para identificar el microorganismo responsable de la formación de histamina en las muestras. En cuatro de los cinco quesos seleccionados, el gen hdc correspondió al microorganismo Lentilactobacillus parabuchneri, referido como principal productor de histamina en quesos, mientras que en uno de los quesos se identificó a Tetragenococcus halophilus, microorganismo que presenta el gen hdc ubicado en un plásmido inestable.Una vez conocidos los microorganismos productores de histamina en quesos comerciales, se evaluó la distribución de histamina en cuatro zonas distales de una cuña (corteza periférica e interna y núcleo periférico e interior) de 12 quesos duros de larga maduración producidos con leche cruda de oveja o mezcla de leches, y se procedió a la identificación de los microorganismos que contenían el gen hdc mediante secuenciación Sanger. Se observó un patrón de distribución de histamina en las diferentes zonas acumulándose en el centro y disminuyendo en la corteza. Sin embargo, no se pudo establecer una correlación entre la distribución de la histamina y la microbiota presente, ya que la distribución de los microorganismos era similar en todas las partes del queso. En cuanto a la relación entre el análisis de las propiedades físicas y químicas de las diferentes áreas y la concentración de histamina se observó que la histamina tendía a acumularse en los lugares más salados, más húmedos y menos oxidados de la cuña.Finalmente, se evaluaron medidas basadas en el uso de la enzima Diamino Oxidasa (DAO) y de microorganismos potencialmente degradadores de histamina (Lacticaseibacillus casei 4a y 18b, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) 4005 y Streptococcus salivarius subsp. thermophilus CECT 7207, dos cultivos iniciadores comerciales de yogur (Abiasa y CHR Hansen), y la levadura Debaryomyces hansenii), para disminuir la acumulación en quesos de este metabolito tras 100 días de maduración. Se fabricaron un total de 8 lotes de queso de leche de vaca pasteurizada a los que se les añadieron los microorganismos mencionados anteriormente o la enzima DAO, todos ellos conteniendo L. parabuchneri DSM 5987 (excepto el lote de queso de control negativo), responsable de la producción natural de histamina en el queso. Se analizaron las propiedades fisicoquímicas y sensoriales (olor), así como la concentración de histamina a lo largo de 100 días de maduración del queso. Como resultado, todas las estrategias aplicadas redujeron significativamente la concentración de histamina. Al final del periodo de maduración, se consiguió una reducción de más del 45% en los quesos preparados con D. hansenii, del 43% en aquellos preparados con las dos cepas de L. casei, del 42% en los quesos elaborados con L. bulgaricus y S. thermophilus, y del 23% en aquellos a los que se adicionó DAO. No se observaron cambios fisicoquímicos significativos (peso, pH, actividad del agua, color o textura) en los quesos como consecuencia de la adición de los cultivos microbianos o DAO. Sin embargo, la adición de microorganismos degradadores de histamina produjo quesos con un olor diferente al percibido en las muestras control, que no fue percibido como desagradable.Como conclusión, cabe destacar la puesta a punto de un método sensible para la determinación de ABs en productos lácteos que permite detectar niveles bajos de estos metabolitos. Los microorganismos identificados como productores de histamina en quesos no proceden de los cultivos iniciadores empleados en su elaboración, sino que son microorganismos contaminantes. La concentración de histamina aumenta en las zonas interiores y disminuye en las zonas exteriores del queso lo que desvela la importancia de llevar a cabo una estrategia de muestreo cuando se pretende determinar la cantidad de histamina presente en un queso. La elaboración de quesos con bajos niveles de histamina se podría lograr mediante el empleo de técnicas sensibles para la determinación de este metabolito en productos lácteos que permitiera prevenir su entrada en el mercado, la utilización de leche libre de microorganismos productores de histamina, la limpieza y desinfección de los equipos para evitar la contaminación durante la obtención de la leche y su procesado en la industria láctea con microorganismos productores de histamina, o el uso de microorganismos degradadores o DAO que pudieran degradar la histamina a lo largo de la etapa de maduración del queso.<br /

Actividad antimicrobiana de matrices físicas y alimentarias frente a microorganismos patógenos y alterantes de interés

Peer reviewe

Combination of SPE and fluorescent detection of AQC-derivatives for the determination at sub-mg/L levels of biogenic amines in dairy products

Biogenic amines (BAs) are compounds generated by decarboxylation of their amino acid precursors. Their intake, even at low concentrations, can lead to several types of health problems in sensitive individuals. As they can be easily formed in fermented dairy products, their quantitative determination is very relevant. In the present paper, a method for the quantitative determination of four biogenic amines in different dairy products has been developed, validated and applied to 37 samples of milk, 23 of yogurt, and 14 of kefir. Amines were selectively extracted using solid phase extraction, subsequently derivatizatized with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate and further determined by High Performance Liquid Chromatography with fluorescence detection. The method’s sensitivity was highly satisfactory, with limits of detection lower than 0.2 mg/L. Optimal linearity and repeatability were also achieved. BAs were not detected in most of the milk samples, but they were found frequently at high levels in yogurt and kefir samples, reaching values of up to 79 mg/kg total BAs in kefir samples. Levels measured should not be a cause for concern for the population at large, but should be known by BAs-sensitive individuals