Development of Jak1 Sirna Medıated Nanotherapeutıcs for Non-Melanoma Skın Cancer Therapy

Non-melanoma skin cancer is one of the most common cancers with still no effective treatment. Due to the side effects observed after long and high dose treatments and acquired resistance to the chemotherapy drugs, different attempts have been made to overcome these problems and to provide more effective treatment with low dose usage. With successful results and advances in gene therapy, it has been observed that concurrent gene silencing and drug administration may be a better approach in cancer treatment compared to drug/drug combination therapies. The main purpose of this study was to investigate the therapeutic efficiency of liposomal formulation for delivery of both JAK1 siRNA and 5-Fluorouracil (5-FU) in non-melanoma skin cancer. For this purpose, combined nanoliposome formulations containing both 5-fluorouracil (5-FU), a cytotoxic chemotherapeutic agent, or JAK1 (Janus kinase 1) siRNA have been prepared and characterized in terms of size, polydispersity, zeta potential, morphology, encapsulation efficiency, cytotoxicity, and stability. Prepared liposomal nanoformulations were uniform and had a size of 80-120 nm, the PDI below 0.3, and remained stable for a period of 3 months. Positive zeta potential of liposomal nanoformulations successfully internalized across cell membrane, and delivered 6-FAM or cy5 labeled siRNA to the cells even within 30 minutes of incubation, and could remain in the A-431 cells as observed under fluorescence or confocal microscope. Encapsulation or hydrophilic 5-FU in the nanoliposomes was achieved at different drug/lipid ratios, and showed the highest encapsulation efficiency at the 0.2 drug/lipid ratio, and had the 1st order release kinetics. In the evaluation of nanoliposome formulations toxicities, cells express viability over 80 % for the treatment concentrations up to 5x103 µg/mL after 24 hours of incubation. Prolonged incubation reduced cell viability to 70 % at the concentration of 5x103 µg/mL. Delivery of 5-FU using nanoliposome formulations resulted in a significant reduction of cell viability after 24 hours incubation at the 5-FU concentration of 5 µM and above (p<0.05). Evaluation of JAK1 mRNA expression was done using RT-qPCR, proceeding with relative protein expression using Western Blot analysis. Nanoliposome formulations containing JAK1 siRNA were effective for in vitro gene silencing, by inhibition of mRNA expression by 50 %. Similarly, JAK1 protein level was also reduced after treatment with JAK1 siRNA nanoliposomes. After finalizing in vitro gene knockdown studies, in vivo studies have been initiated. Treatment efficacy with the most optimal formulations was evaluated in nude male mice. First of all, the tumor model was formed with inoculation of 1X106 to the right flank region of mice and after tumor volume reached approximately 50-100 mm3, intratumoral administration of nanoliposome formulations containing 5-FU or JAK1 have been initiated. Nanoliposomes formulations containing either 5-FU, JAK1 siRNA or both, significantly suppressed the tumor volume increase compared to the control group (p<0.05), showing the tumor inhibitory rate of approximately 80 % after 28 days of treatment. With relatively less tumor areas observed, 5-FU or siRNA containing groups also reduced the expression of JAK1, ERK, AKT, pAKT, pERK proteins. In addition, JAK1-siRNA loaded nanotherapeutics strongly induced apoptosis in vivo. Based on these findings, the delivery of JAK1 siRNA and 5-FU by developed nanoliposomes appears to be a promising treatment strategy for non-melanoma skin cancer.Non-melanom cilt kanseri, henüz etkili tedavisi olmayan en yaygın kanser tiplerinden biridir. Uzun süre ve yüksek dozda uygulanan kemoterapötik ilaç tedavisi sonrasında görülen yan etkiler ve ilaçlara karşı kazanılan direnç nedeniyle bu sorunların aşılması ve düşük doz kullanımı ile daha etkin tedavi sağlanması için farklı girişimlerde bulunulmuştur. Bununla birlikte gen tedavisindeki başarılı sonuçlar ve ilerlemeler; gen susturma ve ilaç uygulamasının kanser tedavisinde ilaç/ilaç kombinasyon tedavilerine göre daha iyi bir yaklaşım olabileceği düşünülmektedir. Bu çalışma kapsamında, potansiyel siRNA aracılı terapötiklere olan ilgi göz önünde bulundurularak, hem JAK1 siRNA hem de 5-Fluorourasilin (5-FU) hedef dokuya taşınması amacıyla kombine lipozom formülasyonları geliştirilerek non-melanom cilt kanserinde terapötik etkinliği araştırılmıştır. Bu amaçla, sitotoksik bir kemoterapötik ajan olan 5-Florourasil (5-FU) ve/veya JAK1 (Janus kinaz 1) siRNA içeren farklı nanolipozom formülasyonları hazırlanarak boyut, polidispersite, zeta potansiyeli, morfoloji, enkapsülasyon etkinliği, sitotoksite ve stabilite açısından değerlendirilmiştir. Hazırlanan lipozom nanoformülasyonların boyutları 80-120 nm arasında olup PDI değeri ise 0.3’ün altında bulunarak homojen bir dağılım gösterdiği gözlenmiştir. Aynı zamanda hazırlanan lipozom formülasyonların 3 ay boyunca stabilitelerini korudukları tespit edilmiştir. Pozitif zeta potansiyel değerlerine sahip lipozomal nanoformülasyonların hücre içine kolaylıkla geçtiği izlenmiştir. 6-FAM veya cy5 işaretli siRNA içeren lipozomların inkübasyondan sonraki 30 dakika içinde hücre içine girdiği ve A-431 hücrelerinde uzun süre kaldığı floresan ve konfokal mikroskop ile gözlenmiştir. Hidrofilik bir aktif madde olan 5-FU’nun nanolipozomlara yüklenmesi, farklı ilaç/lipit oranlarında gerçekleştirilmiştir. 0.2 ilaç/lipid oranında en yüksek enkapülasyon etkinliği görülmüştür. Hazırlanan lipozomlardan 5-FU’nun ilk 2 saatte hızlı salımı gerçekleşerek daha sonra platoya ulaştığı ve birinci dereceden kinetik modele uyumlu salım profili sergilediği gözlenmiştir. Nanolipozom formülasyonların toksisiteleri değerlendirildiğinde; hücrelerin 24 saat inkübasyondan sonra 5x103 µg/mL'ye kadar tedavi konsantrasyonları için % 80'in üzerinde canlılıklarını korudukları görülmüştür. Uzun süreli inkübasyonda ise hücre canlılığının 5x103 µg/mL konsantrasyonda % 70'e düştüğü gözlenmiştir. 5-FU içeren nanolipozom formülasyonlarında 5 µM ve üzeri 5-FU konsantrasyonunda 24 saat inkübasyondan sonra hücre canlılığında önemli bir azalma ile sonuçlanmıştır (p<0.05). JAK1 mRNA ekspresyonunun değerlendirilmesi için RT-qPCR ve protein ekspresyonu için ise Western Blot analizi kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlarda; JAK1 siRNA yüklü nanolipozomların başarılı bir şekilde A-431 hücrelerinin içine girdiği, hücre içerisinde uzun süre kaldığı ve JAK1 mRNA ekspresyon seviyesini % 50 oranında azalttığı gösterilmiştir. Benzer şekilde, JAK1 siRNA nanolipozomları ile tedaviden sonra JAK1 protein seviyesinde azaldıği gözlenmiştir. İn vitro gen susturma çalışmalarının tamamlanmasından sonra geliştirilen nanolipozom formülasyonlarının antitumoral etkinliği in vivo çalışmalar ile değerlendirilmiştir. Bu amaçla farelerin sağ yan bölgesine 1X106 A-431 hücre inokülasyonu ile tümör modeli oluşturulmuş ve tümör hacmi yaklaşık 50-100 mm3'e ulaştıktan sonra 5-FU veya JAK1 içeren nanolipozom formülasyonlarının intratümoral olarak uygulanmıştır. 5-FU, JAK1 siRNA veya her ikisini de içeren kombine nanolipozom formülasyonlarının kontrol grubuna kıyasla tümör hacmi artışının önemli ölçüde azaldığı görülmüştür (p<0.05). 28 günlük tedaviden sonra, tümör inhibisyon oranı yaklaşık % 80 olarak hesaplanmıştır. Tedavi gruplarında daha az tümör alanı gözlemlenmesinin yanısıra, 5-FU veya siRNA içeren gruplarda JAK1, ERK, AKT, pAKT, pERK protein ekspresyonlarının azaldığı gözlenmiştir. Ayrıca JAK1 siRNA yüklü nanoterapötiklerin in vivo’da güçlü bir şekilde apoptozu indüklediği görülmüştür. Bu bulgulara dayanarak, JAK1 siRNA ve 5-FU ile geliştirilen kombine lipozom nanoformülasyonlarının, non-melanom cilt kanserinin tedavisi için potansiyel bir nanoterapötik yaklaşım olacağı düşünülmektedir