Xaperones bacterianes per millorar la producció de proteïnes a cèl·lules d'insecte

La possibilitat d'obtenir proteïnes amb aplicacions industrials o terapèutiques mitjançant la tecnologia del DNA recombinant ha revolucionat la indústria biotecnològica. Malgrat això, la producció de proteïnes recombinants en sistemes heteròlegs encara no està optimitzada, i moltes vegades aquestes proteïnes s'obtenen en forma insoluble. La selecció d'un sistema d'expressió adequat és important per aconseguir obtenir la proteïna en una forma funcional i soluble. En aquesta tesi s'ha utilitzat una GFP recombinant com a proteïna model per a estudiar l'agregació i activitat durant la producció de proteïnes recombinants en Escherichia coli i en el sistema d'expressió de baculovirus.La posibilidad de obtener proteínas con aplicaciones industriales o terapéuticas mediante la tecnología del DNA recombinante ha revolucionado la industria biotecnológica. A pesar de esto, la producción de proteínas recombinantes en sistemas heterólogos aún no está optimizada y, muchas veces, estas proteínas se obtienen en forma insoluble. La selección de un sistema de expresión adecuado es importante para conseguir obtener la proteína en una forma funcional y soluble. En esta tesis se ha utilizado una GFP recombinante como proteína modelo para estudiar agregación y actividad durante la producción de proteínas recombinantes en Escherichia coli y en el sistema de expresión de baculovirus.Recombinant DNA technology boosted the production of recombinant proteins with industrial or therapeutic applications, which transformed biotechnological industry. Despite this, recombinant protein production in heterologous systems is not yet optimized, and these proteins are often obtained as insoluble deposits. Choice of an appropriate expression system is important for proteins to be produced in a soluble and functional form. In this thesis, a recombinant GFP has been used as a model protein to study aggregation and biological activity during recombinant protein production in Escherichia coli and the baculovirus expression system

Desenvolupament de models experimentals murins per a l'avaluació de la virulència i patogenicitat de soques d'Escherichia coli

Les infeccions urinàries constitueixen una de les infeccions bacterianes més freqüents tant en la comunitat com en l'àmbit hospitalari, que afecten dones sanes i pacients amb factors predisponents. Escherichia coli és sens dubte l'agent causal més freqüent d'aquestes infeccions. El qual també, s'ha constatat com a causant d'altres infeccions extraintestinals com ara colecistitis, peritonitis, meningitis i sèpsia. Paradoxalment, E. coli és el principal component de la flora facultativa comensal de l'intestí humà i altres animals. Basant-se en tècniques moleculars s'ha demostrat que aquesta espècie pot dividir-se principalment en quatre grups filogenètics principals: A, B1, B2 i D. S'ha pogut comprovar que les infeccions extraintestinals estan causades majoritàriament per soques del filogrup B2 i en menor proporció del D. D'altra banda s'ha pogut demostrar en diversos estudis experimentals i de correlació estadística, que les soques d'aquests filogrups associades a infecció porten amb més freqüència un conjunt de factors de virulència als que s'atribueixen les funcions patogèniques; com són les adhesines, els quelants de ferro, les toxines, les càpsules i d'altres. No obstant això, hi ha observacions que posen en qüestió aquestes troballes, com és el fet que amb certa freqüència soques dels filogrups A i B1, portadores d'escassos factors de virulència, causin infeccions urinàries i sèpsia en persones sanes. Això, i estudis específics per a cadascun d'aquest factors han qüestionat el seu valor patogènic; considerats de forma aïllada o col·lectivament. La forta correlació entre el filogrup i l'acció patògena podria indicar la presència de factors de virulència desconeguts i la importància de la seva associació. En aquest context, l'única manera de conèixer si una soca és capaç de fer infeccions extraintestinals i en particular infeccions urinàries, és avaluar-les en models experimentals, amb aquesta finalitat s'han descrit dos models in vivo. El primer d'ells, valora la capacitat de causar infecció generalitzada una vegada s'han sobrepassat les barreres naturals de l'hoste, i de permetre la disseminació del patogen al sistema circulatori i causant bacterièmia o septicèmia. Mentre que el segon model, d'infecció urinària ascendent, avalua el potencial virulent i patogen en el sistema urinari. I la capacitat del bacteri per ascendir des de la bufeta fins als ronyons quan no s'apliquen pautes terapèutiques per a contenir la infecció urinària de les vies baixes. Per tant, els principals objectius d'aquesta tesi doctoral han estat: i) determinar el grup filogenètic, els factors de virulència i altres característiques biològiques d'un grup de soques d'E. coli d'origen urinari i intestinal; amb la finalitat de seleccionar les soques utilitzades per als estudis amb els models experimentals in vivo; ii) estandarditzar dos models murins d'experimentació animal per a l'avaluació d'infeccions extraintestinals causades per E. coli i iii) avaluar el potencial virulent i patogen en els dos models murins de les soques d'E. coli prèviament seleccionades. El treball realitzat han permès incorporar en el grup de Microbiologia de l'Institut de Recerca Vall d'Hebron, dins del Servei de Microbiologia del Hospital Universitari Vall d'Hebron; dos models experimentals murins per a l'avaluació de la virulència i patogenicitat de soques d'E. coli. Així mateix, també ha permès la caracterització in vitro d'un grup de soques heterogènies, aportant les primeres proves de conceptes dels models. Els dos models murins estandarditzats i les dades aportades per aquesta tesi obren futures vies de treball com són: i) estudis de virulència de microorganismes causants de sèpsies o infecció urinària, ii) monitorització d'infeccions extraintestinals per a la determinació de la implicació específica de determinants de virulència mitjançant tecnologies d'expressió in vivo o assajos de competició de mutants, iii) avaluació de la eficàcia, la farmacocinètica i la farmacodinàmica de nous antimicrobianes, entre altres.Urinary tract infections are one of the most common bacterial infections in the community and in hospitals, affecting healthy women and patients with predisposing factors. Escherichia coli is certainly the most common casual agent of these infections, which also is the cause of other extraintestinal infections such as cholecystitis, peritonitis, meningitis and sepsis. Paradoxically, E. coli is the main component of facultative commensal flora of the human intestine and other animals. Using molecular techniques it has been proven that this specie can be divided into four main phylogenetic groups, named A, B1, B2 and D. The majority of the extraintestinal infections are caused by strains from phylogenetic group B2 and in a less extent by group D strains. Moreover, several experimental studies and statistical correlations have demonstrated that the strains associated to infections, present more often a set of virulence factors attributed to features such as pathogenic adhesins, iron chelates, toxins, and capsules, among others. However, some observations are calling into question these results; such as the fact that frequently strains from phylogenetic groups A and B1 (carriers of fewer virulence factors) cause urinary tract infections and sepsis in healthy people. Because of this result and other studies carried out for each of the virulence factors, the pathogenic value of the factors, singly and collectively, has been questioned. The strong correlation among the pathogenic action of phylogenetic groups may indicate the presence of unknown virulence factors and the importance of their relationship with extraintestinal infections. Taking into account the background, the only way to know if a strain is capable of producing extraintestinal infection and particularly urinary tract infection, is evaluating them using experimental models. For this purpose, two in vivo models were described. The first one recognizes the worth of the ability to cause widespread infection once the natural barriers of the host have been exceeded, allowing the spread of the pathogen into the circulatory system causing bacteremia or septicemia. Meanwhile, the ascending urinary infection model assesses the pathogenicity and the virulent potential of the strains in the urinary system, besides the capability of the bacteria to ascend from the bladder to the kidneys without any treatment to contain the lower urinary tract infection Therefore, the main objectives of this thesis were: i) to determine the phylogenetic group, virulence factors, and other biological characteristics of urinary and intestinal E. coli strains, in order to select the strains to be used for in vivo experimental studies ii) to standardize two murine models for the evaluation of extraintestinal infections caused by E. coli, and iii) to evaluate the pathogenicity and the virulent potential of previously selected E. coli strains in murins models. The work has allowed the incorporation of two experimental murine models for the evaluation of the virulence and the pathogenicity of Escherichia coli strains into the Microbiology group of Vall d'Hebron Institut de Recerca in the Microbiology department of Hospital Universitari Vall d'Hebron. Likewise, it has allowed the in vitro characterization of a heterogeneous group of strains, providing the first evidence of concepts of those models. The two standardized murine models and the data provided by this thesis open several lines for future work, such as: i) studying the virulence of microorganisms causing sepsis or urinary tract infection, ii) monitoring of extraintestinal infections to determine the specific involvement of certain virulence factors by means of in vivo expression technologies or mutants competition assays, and iii) evaluating the efficacy, pharmacokinetics and pharmacodynamics of new antimicrobials, among other studies

Estudio de la inestabilidad genómica inducida por transposición en los híbridos interespecíficos de Drosophila buzzatii y Drosophila koepferae

Descripció del recurs: el 01 setembre 2012El genoma de los híbridos interespecíficos y las especies parentales D. buzzatii y D. koepferae ha sido estudiado utilizando marcadores moleculares AFLP. En el genoma de los híbridos segregan de novo marcadores AFLP de inestabilidad que no segregan en las especies parentales, señal de que el genoma híbrido es inestable. La caracterización de los marcadores AFLP de inestabilidad ha revelado que un amplio porcentaje, que va desde el 16%, en la primera generación de híbridos, hasta un 90% en las generaciones de híbridos segmentales, está asociado a la movilización de al menos 34 elementos transponibles de clase I y II. Las tasas de transposición estimadas en los híbridos y las especies parentales para los elementos Osvaldo, Helena y Galileo confirman que hay un incremento estadísticamente significativo de la transposición del retrotransposon Osvaldo (10-2) en las tres generaciones analizadas, mientras que la tasa de transposición de Helena y Galileo se incrementa (10-2) en la generación R1 pero decrecen en la generación R3 hasta el nivel de la transposición basal de las especies parentales D. buzzatii y D. koepferae (10-3). Las inserciones de los elementos Osvaldo, Helena y Galileo observadas por FISH y por transposon display señalan que la mayor parte de las inserciones se encuentran en la heterocromatina, región en la que se encuentran silenciados. La movilización de los 34 elementos transponibles en el genoma de los híbridos evidencia que en estos genomas ocurre una reorganización genómica inducida por la movilización de los elementos transponibles, y pone de manifiesto que el estrés genómico generado por la hibridación inhibe momentáneamente los mecanismos que controlan la transposición de los ETs en el genoma híbrido, permitiendo su movilización.The genomes of the species D. buzzatii and D. koepferae and their interspecific hybrids have been studied using AFLPs markers. In the hybrids genome markers that are absent in the parental species have been detected unveiling genome instability. High amount of AFLP instability markers, ranging from 16 % in hybrids R1 to 90 % in segmental hybrids, are related to mobilization of at least 34 transposable elements of classes I and II. Transposition rates of Osvaldo retrotransposon confirm the increase of transposition in the three generations of hybridization, however Helena and Galileo transposable elements only increase transposition in generation R1 (10-2), but show transposition rate at the basal level (10-3) in generation R3 as in parental species. Insertions of Osvaldo, Helena and Galileo observed by FISH and by the transposon display technique indicate that most of the insertions are located in the heterocromatic regions, where they are silenced. Mobilization of 34 transposable elements in the hybrid genome bolsters that a genome reorganization is occurring in the hybrids. This reorganization is probably induced when hybrid genomic stress inactivates the control mechanisms of transposable elements mobilization

Monitorización continúa de la colonización por bacterias multirresistentes en una unidad neonatal de cuidados intensivos. relación entre colonización e infección

Las infecciones adquiridas durante el periodo postnatal están producidas principalmente por bacterias que forman parte de la flora humana normal o del medio ambiente. La adquisición de multirresistencia por parte de estas bacterias (BMR) constituye un problema muy grave ya que los neonatos son una población muy susceptible a los procesos infecciosos. El número de antibióticos disponibles para tratar estas infecciones es muy limitado, y algunos son tóxicos, por ello es muy importante conocer el número y la dinámica de las colonizaciones y esclarecer si son un determinante de infección y en qué proporción. Así mismo es relevante conocer en números absolutos y porcentuales el significado de estas infecciones en relación a otras infecciones bacterianas y al total de todas ellas. Esta información ayudaría a establecer la importancia de los cultivos regulares para controlar las colonizaciones, la necesidad de efectuar o no aislamientos de los niños para evitar la difusión de estas bacterias y establecer los tratamientos empíricos adecuados. Existen pocos datos disponibles en la literatura acerca de la incidencia de la infección nosocomial en las Unidades de Cuidados Intensivos neonatales (UCIN) españolas. Los objetivos de este trabajo son observar el grado de colonización por bacterias multirresistentes de los niños de la UCIN del Hospital Vall d'Hebron y determinar la capacidad de estas bacterias para causar enfermedades infecciosas en los niños colonizados. Para ello, se ha determinado a lo largo de un periodo de cinco meses, la flora grampositiva y gramnegativa multirresistente que coloniza el intestino de los niños a su ingreso, así como su su evolución durante su permanencia en la Unidad. Además se he estudiado la transmisión cruzada de los microorganismos resistentes entre los distintos niños de la UCIN y las enfermedades infecciosas esporádicas o endémicas desarrolladas por ellos a lo largo del periodo de estudio, en relación con la flora multirresistente de colonización intestinal. Por último, en este trabajo se han determinado los mecanismos genéticos implicados en la resistencia de las bacterias detectadas con el fin de conocer si ha existido transferencia genética entre las bacterias de la Unidad. Los resultados de este estudio han mostrado que durante el periodo de estudio, el 51% de los niños que han estado ingresados en la UCIN se han colonizado por una bacteria multirresistente, siendo Klebsiella pneumoniae y Enterobacter cloacae, las especies más prevalentes. La colonización por una BMR se asoció a un mayor tiempo de estancia en UCIN y los principales factores que se asociaron a la colonización fueron la prematuridad extrema (nacimiento antes de la semana 30 de gestación), el bajo peso, la lactancia materna, la administración de nutrición parenteral y la toma de antibióticos. Se observó una enorme dinámica en la colonización de los niños condicionada por la duración variable de la estancia en la Unidad, por los cambios de box, la salida a otras unidades y en ocasiones al reingreso, así como la aparición y difusión entre los niños de las diversas especies multirresistentes detectadas. En total, fueron diecisietes los brotes detectados. De estos, 6 afectaron a entre 4 y 46 niños y los once restantes a entre 1 y 3 niños. A lo largo del periodo de estudio, las infecciones sistémicas fueron más frecuentes que las superficiales estando las primeras causadas por bacterias multirresistentes en menor proporción que las superficiales. Las especies bacterianas multirresistentes que causaron mayor proporción de infección respecto a la colonización fueron K. pneumoniae, E. cloacae y C freundi. Todo esto pone de manifiesto la complejidad de las colonizaciones por bacterias multirresistentes tanto debido a las propias bacterias, por sus variedades clonales, su dinámica de permanencia, difusión, desaparición y reaparición, como por la propia complejidad que presentan los niños en sus procesos patológicos, su movilidad y otros factores indeterminados.Infections acquired during the postnatal period are mainly produced by bacteria that are part of normal human flora or the environment. The acquisition of multidrug resistance by these bacteria (MRB) is a very serious problem because neonates are highly susceptible to infections. The number of antibiotics available to treat these infections is very limited, and some are toxic, so it is very important to know the number and dynamics of colonization and to clarify whether they are determinates of infection and in what proportion. Also is important to know the proportion of these infections in relation to other bacterial infections and the total of all of them. This information would help to establish the importance of making regular screenings to control colonization, the need for isolation of children to prevent the spread of these bacteria and to establish appropriate empirical treatments. There are few data available in the literature on the incidence of nosocomial infection in Spanish Neonatal Intensive Care Units (NICU). The objectives of this work are to observe the level of colonization by multiresistant bacteria of children in the NICU of the Hospital Vall d'Hebron and to determine the ability of these bacteria to cause infectious disease in colonized children. To do this, it has been determined over a period of five months, the multidrug-resistant Gram-positive and Gram-negative bacteria that colonizes the intestine of children at the income as well as their evolution during their stay in the NICU. In addition, it has been studied cross-transmission events of resistant bacteria between different NICU infants and sporadic or endemic infectious diseases developed by them throughout the study period, in relation to its colonizing antibiotic-resistant intestinal flora. Finally, in this study the genetic mechanisms involved in the resistance of bacteria detected has been determined, in order to determine whether there has been gene transfer between the bacteria at the Unit. The results of this study have shown that during the study period, 51% of children who have been admitted to the NICU were colonized by multiresistant bacteria, being Klebsiella pneumoniae and Enterobacter cloacae, the most prevalent species. Colonization by a MRB was associated with a longer stay in NICU and the main factors associated with colonization were extreme prematurity (birth before 30 weeks of gestation), low birth weight, breastfeeding, parenteral nutrition and taking antibiotics. A high dynamic in the colonization of children was detected. This was conditioned by the variable length of stay in the unit, by box changes, discharge to other units and sometimes re-entry. Altogether, there were detected seventeen outbreaks. Of these, 6 affected between 4 and 46 children and the remaining eleven between 1 and 3. Throughout the study period, systemic infections were more frequent than superficial being the first ones caused by multidrug-resistant bacteria to a lesser extent than surface. All this shows the complexity of colonization by multiresistant bacteria both because the bacteria themselves, for their clonal varieties, dynamics of permanence, dissemination, disappearance and reappearance, and the complexity itself of children in their pathological processes, mobility and other undetermined factors

Ricard Guerrero, catedrátic de Microbiologia de la Universitat de Barcelona

Ricard Guerrero ha participat en diversos projectes científics pero destaca a nivell espanyol per ser el primer a introduir la teoria de l'ecologia microbiana. "Sense els microbis la vida en el nostre planeta no seria possible", comenta Guerrero, "perquè des del moment en què naixem necessitem dels bacteris per viure".Ricard Guerrero ha participado en varios proyectos científicos y destacaen España por ser el primero en introducir la teoría de la ecologíamicrobiana. "Sin los microbios la vida en nuestro planeta no seríaposible", comentaba Guerrero, "porque desde el momento en quenacemos necesitamos de las bacterias para vivir".Guerrero has taken part in various scientific projects and is known inSpain as the first person to introduce the theory of microbial ecology."Without microbes, life on our planet would be impossible", saysGuerrero. "From the moment we are born we need bacteria to live"

Tires de paper per avaluar la toxicitat de l'aigua

Les tècniques d'anàlisis químiques utilitzades per analitzar mostres d'aigua que poden contenir diversos contaminants tenen certes limitacions. Investigadors del grup de Microbiologia Ambiental del Departament de Genètica i Microbiologia de la UAB han desenvolupat una tècnica senzilla i de baix cost per a la detecció de toxicitat en aigua. Aquesta consisteix en monitoritzar el canvi de color de matrius de paper que contenen bacteris i un colorant que canvia de color quant és respirat pels microorganismes.Las técnicas de análisis químicos utilizadas para analizar muestras de agua que pueden contener diversos contaminantes tienen ciertas limitaciones. Investigadores del grupo de Microbiología Ambiental del Departamento de Genética y Microbiología de la UAB han desarrollado una técnica sencilla y de bajo coste para la detección de toxicidad en agua. Ésta consiste en monitorizar el cambio de color de matrices de papel que contienen bacterias y un colorante que cambia de color cuando es respirado por los microorganismos

Spectrophotometric methods for the determination of photosynthetic pigments in stratified lakes : a critical analysis based on comparisons with HPLC determinations in a model lake

High-performance liquid chromatography (HPLC) is an accurate method for photosynthetic pigment analysis; however, spectrophotometric equations are also frequently used for pigment quantification in aquatic systems. Here, we present a critical analysis of the most-used spectrophotometric equations by comparing the results obtained using these equations with unambiguous HPLC determinations. The study was performed in Lake La Cruz (central Spain). In this meromictic lake with strong thermal stratification, photosynthetic populations occur in different, vertically stratified layers. Eukaryotic algae and picocyanobacteria are mostly located in oxic layers, whereas purple sulphur bacteria grow at the oxic-anoxic interface and below, and green sulphur bacteria occur primarily in deeper anoxic layers. This broad diversity of photosynthetic microorganisms involves a complex mixture of photosynthetic pigments that often exhibit overlapping absorption spectra. We tested spectrophotometric equations using samples that represented the entire range of spatial and temporal variability of the lake. For chlorophyll-a, the best correlations with all tested equations were observed for oxic layers. Regardless of where the sample was obtained, the best fit for chlorophyll-a was produced by the equation of Overmann & Tilzer, which is specifically designed to handle mixtures of chlorophyll-a and bacteriochlorophyll-d from green sulphur bacteria. Trichromatic equations for determining chlorophyll-b and -c exhibited strong interferences in anoxic waters, whereas in the upper layers of the lake, concentrations of these pigments were usually below the detection limit, restricting the use of these equations. The equations of Takahashi & Ichimura for bacterial pigments slightly overestimated both bacteriochlorophyll-a and -d by approximately 10 % and underestimated bacteriochlorophyll-c by nearly 23 %, although for bacteriochlorophyll-d, the correlation was better than those obtained using the dichromatic equations of Parkin & Brock and Overmann & Tilzer, respectively. Total carotenoid abundance can be assessed with the equation designed for this purpose by Strickland & Parsons (1972); however, the accuracy of the results differs with depth and is strongly biased by the presence of the bacterial carotenoid okenone. On the other hand, dual-wavelength carotenoid-to-chlorophyll-a ratios (430/665 and 480/665) only produced acceptable results in the epilimnion, with the occurrence of the bacterial carotenoid okenone in the microaerobic and anoxic layers again producing significant interference. Additionally, the wide variation with depth of the carotenoid composition undermined the validity of these dual-wavelength ratios. In conclusion, our findings indicate that a complete and unambiguous study of photosynthetic pigments in highly stratified lakes with overlapping populations of phototrophic microorganisms requires the use of HPLC techniques. Anyway, our results demonstrate that chlorophyll-a and bacteriochlorophyll-a and -d can be directly measured in oxic and anoxic layers, respectively, using spectrophotometric methods with an error lower than 10 %. However, according to our results, chlorophyll-b and -c and bacteriochlorophyll-c cannot be accurately estimated by spectrophotometric methods in stratified lakes.La cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) es un método preciso para el análisis de pigmentos fotosintéticos, sin embargo las ecuaciones espectrofotométricas todavía se usan frecuentemente en sistemas acuáticos. En este trabajo mostramos un análisis crítico de algunas de estas ecuaciones comparando los resultados obtenidos con las determinaciones más precisas realizadas por HPLC. El estudio se realizó tomando como modelo la Laguna de La Cruz (centro de España). En este lago meromíctico, que además presenta una fuerte estratificación térmica estival, las poblaciones de microorganismos fotosintéticos se sitúan verticalmente estratificadas en diferentes capas. Mientras que las algas eucariotas y las picocianobacterias se localizan en las capas óxicas, las bacterias púrpuras del azufre crecen en la interfase óxico-anóxica y por debajo de esta y a las bacterias verdes del azufre se localizan en capas anóxicas más profundas. Esta amplia diversidad de microorganismos fotosintéticos implica una compleja mezcla de pigmentos fotosintéticos en los extractos, los cuales a menudo muestran espectros de absorción que se superponen. Hemos ensayado las ecuaciones espectrofotométricas con muestras que abarcan toda la variabilidad espacial y temporal del lago. Para la clorofila-a encontramos buenas correlaciones en las capas óxicas para la mayoría de las ecuaciones ensayadas. Sin embargo, la ecuación que mejor funciona en general para la determinación de la concentración de clorofila-a, independientemente del origen de la muestra, es la dada por Overmann & Tilzer, que está diseñada específicamente para mezclas de clorofila-a con bacterioclorofila-d de bacterias verdes del azufre. Las ecuaciones tricromáticas para la determinación de clorofila-b y c presentaron fuertes interferencias en aguas anóxicas, mientras que en las capas superiores del lago las concentraciones se encontraron normalmente por debajo del límite de detección, lo que restringía la posibilidad de uso de estas ecuaciones. Las ecuaciones de Takahashi & Ichimura (1970) para pigmentos bacterianos sobreestimaban tanto la concentración de bacterioclorofila-a como la d, aproximadamente en un 10 %, y subestimaban la concentración de bacterioclorofila-c casi en un 23 %; si bien para la determinación de bacterioclorofila-d la correlación fue mejor que la obtenida por las ecuaciones dicromáticas de Parkin & Brock y de Overmann & Tilzer. La abun- dancia de carotenos totales puede ser estimada por la ecuación de Strickland & Parsons (1972) diseñada para este propósito, sin embargo la precisión en los resultados difiere con la profundidad y se ve tremendamente sesgada por la presencia del caroteno bacteriano okenona. Por otro lado, las relaciones caroteno/clorofila-a basada en medidas a doble longitud de onda (430/665 y 480/665) solo mostraban resultados aceptables en el epilimnion, ya que en otras capas la aparición de carotenos bacterianos como la okenona produce interferencias significativas. Además, la gran variación en profundidad de la composición de carotenos socava la validez de estas relaciones fundamentadas en medidas a doble longitud de onda. En conclusión, nuestros resultados indican que el estudio de los pigmentos fotosintéticos completo y sin ambigüedades en lagos fuertemente estratificados y consolapamiento de sus poblaciones de organismos fototróficos requiere del uso de HPLC. Sin embargo, nuestros resultados también demuestran que las concentraciones de clorofila-a y bacterioclorofila-a y d pueden ser directamente medidas, tanto en profundidades óxicas como anóxicas, usando ecuaciones espectrofotométricas con un error inferior a un 10 %. Por el contrario, de acuerdo con nuestros resultados ni la concentración de clorofila-b y c, ni la de bacterioclorofila-c pueden ser estimadas con precisión por métodos espectrofotométricos en lagos estratificados

Title : insoluble proteins catch heterologous soluble proteins into inclusion bodies by intermolecular interaction of aggregating peptides

Protein aggregation is a biological event observed in expression systems in which the recombinant protein is produced under stressful conditions surpassing the homeostasis of the protein quality control system. In addition, protein aggregation is also related to conformational diseases in animals as transmissible prion diseases or non-transmissible neurodegenerative diseases including Alzheimer, Parkinson's disease, amyloidosis and multiple system atrophy among others. At the molecular level, the presence of aggregation-prone domains in protein molecules act as seeding igniters to induce the accumulation of protein molecules in protease-resistant clusters by intermolecular interactions. In this work we have studied the aggregating-prone performance of a small peptide (L6K2) with additional antimicrobial activity and we have elucidated the relevance of the accompanying scaffold protein to enhance the aggregating profile of the fusion protein. Furthermore, we demonstrated that the fusion of L6K2 to highly soluble recombinant proteins directs the protein to inclusion bodies (IBs) in E. coli through stereospecific interactions in the presence of an insoluble protein displaying the same aggregating-prone peptide (APP). These data suggest that the molecular bases of protein aggregation are related to the net balance of protein aggregation potential and not only to the presence of APPs. This is then presented as a generic platform to generate hybrid protein aggregates in microbial cell factories for biopharmaceutical and biotechnological applications

Structural and molecular analysis of arteriolar annuli in the retina : implications in diabetic and hypertensive retinopathy /

La vasculatura de la retina presenta características especiales ya que es fundamental que los vasos no interfieran el paso de la luz, que debe atravesar la retina para llegar a los fotoreceptores. El pequeño calibre de los capilares retinianos, junto con los elevados requerimientos metabólicos, hace que la regulación del flujo sanguíneo sea fundamental para el correcto mantenimiento de la homeostasis de la retina. La vasculatura retiniana no presenta inervación, por lo que la influencia de estimulación por parte del sistema nervioso autónomo queda excluida. Además, la barrera hematorretiniana aísla a la retina del efecto tanto de hormonas circulantes como de neurotransmisores. Por lo tanto, la función de la vasculatura retiniana debe efectuarse a través mecanismos locales de regulación del flujo. Los anillos arteriolares son estructuras singulares que aparecen en las ramificaciones laterales de las arteriolas de la retina. Dichas estructuras fueron definidas a mediados del siglo pasado por la presencia de acúmulos de material PAS positivo junto con un aumento de la celularidad. Estudios recientes, evidencian, además, la expresión especifica de ciertos genes en dichas ramificaciones. De todos modos, la mayoría de los estudios que versan sobre el anillo arteriolar son antiguos e incompletos. Por lo tanto, tanto la estructura como la función de los anillos aun deben ser elucidadas. Nuestros resultados han confirmado la presencia los anillos arteriolares en la retina del ratón, en la que aparecen como una estructura cónica e hipercelular de material intensamente teñido mediante PAS. La unión especifica de lectinas, junto con la digestión con amilasa salivar, han determinado que esta tinción especifica con PAS se debe a un incremento del contenido en glucógeno en la células que forman el anillo arteriolar. El profundo análisis morfológico del anillo arteriolar evidenció tres componentes distintos en su estructura: las células endoteliales, las células intersticiales (ICs) y las células musculares lisas. Cada uno de estos componentes presentó un fenotipo estructural y molecular distintivo. De este modo, las células endoteliales mostraron una disminución de la expresión de CD31, junto con un incremento en las expresiones tanto de NADPH diaforasa como del factor de von Willebrand (vWF). Por lo tanto, estos resultados sugieren que las células endoteliales del anillo arteriolar son capaces de inducir vasodilatación así como de mantener un ambiente antitrombótico. En el anillo arteriolar, las células musculares lisas presentaron un cambio en la orientación para abrazar el origen de la arteriola colateral. Esta disposición particular podría indicar una actividad de tipo esfínter mediante un abultamiento de las células del anillo hacia el interior de la luz vascular. Además, el análisis ultraestructural evidenció la existencia de uniones de tipo peg-and-socket entre las células musculares lisas del anillo arteriolar. Este resultado sugiere una contracción del anillo arteriolar coordinada mediante tracción. Asimismo, el incremento de expresión de los principales componentes de la membrana basal, colágeno IV, laminina y fibronectina, evidenció un posible refuerzo de esta. Del mismo modo, una disminución en la colocalización entre colágeno IV y laminina sugiere un cambio en la organización de la membrana basal en el anillo arterial. Las ICs se describen como una nueva población celular en el anillo arteriolar. La morfológía de estas células concordó completamente con el "estándar de oro" de características ultraestructurales establecido para la identificación de las células intersticiales de Cajal. Más aun, las presuntas células intersticiales de Cajal encontradas en el anillo expresaron marcadores específicos de éstas tales como Ano1 y CD44, pese a que la expresión de c-kit nunca se observó. El patrón diferencial en la distribución de los filamentos de F-actina, junto con el incremento en la expresión de -actina y la falta de - SMA, permitieron diferenciar de forma más evidente las ICs de las células musculares lisas en el anillo arteriolar. Los estudios funcionales han sugerido que las ICs del anillo arteriolar llevan a cabo funciones de actividad marcapasos, neuromodulación y mecanotransducción. La alteración del flujo sanguíneo es un evento temprano en enfermedades de la retina como la retinopatía diabética y la retinopatía hipertensa, las mayores causas de ceguera y déficit visual en el mundo. Por lo tanto, la función del anillo arteriolar, así como sus alteraciones durante la retinopatía, pueden ser de interés para el discernimiento de la patofisiología de las retinopatías vasculares. El análisis de los anillos arteriolares en un modelo de diabetes tipo 2 (el ratón db/db) evidenció una alteración en el almacenamiento de glucógeno en las ICs del anillo arteriolar. Además, los estudios en un modelo de hipertensión (el ratón transgénico KAP) mostraron un decremento en la expresión de Ano1 en las ICs durante la retinopatía hipertensa, sugierendo una pérdida de función de los canales de cloro activados por calcio. Por lo tanto, las alteraciones observadas en las ICs podrían producir una pérdida de funcionalidad del anillo arteriolar que conduciría a una alteración en la regulación del flujo sanguíneo durante la retinopatía. Los anillos arteriolares también se han encontrado en la retina humana. Estudios preliminares sugieren que, del mismo modo que ocurre en el ratón, estas estructuras se alteran durante la retinopatía. En conjunto, los resultados obtenidos sugieren que el anillo arteriolar está dotado de características moleculares, estructurales y funcionales que le confieren un papel clave en la regulación del flujo sanguíneo tanto en condiciones fisiológicas como durante la retinopatía.Retinal vasculature shows special characteristics in order to minimize the interference with the light path, which passes through the entire retina to reach the external segment of photoreceptors. The small size and sparse distribution of retinal capillaries, together with the high metabolic demand, makes retinal homeostasis highly dependent on blood flow regulation. Retinal blood vessels are not innervated. Thereby, the influence of autonomic nerve stimulation can be excluded. In addition, blood-retinal barrier isolates the retina from the effect of circulating hormones and neurotransmitters. Thus, for its function retinal vasculature must be controlled through finely tuned local regulatory blood flow mechanisms. Arteriolar annuli are singular structures occurring at side-arm branching sites of retinal arterioles. These structures were defined in the mid last century by the presence of increased PAS-positive material and increased cellularity. Moreover, a recent study has evidenced the specific expression of certain genes at the arteriolar branching points. However, most of the studies dealing with arteriolar annuli are out of date and incomplete. Thus, both structure and function remain to be elucidated. Our results have confirmed the presence of arteriolar annuli in mouse retina, appearing as a conical hypercellular structure of intensely PAS stained material. Lectin specific binding and salivary amylase digestion have determined that specific PAS stain is mainly due to increased glycogen content in cells forming the arteriolar annuli. Detailed morphological analyses of arteriolar annuli have evidenced three different components: endothelial, intersticial (ICs) and smooth muscle cells, showing a distinctive structural and molecular phenotype. In this regard endothelial cells show decreased expression of CD31, together with enhanced NADPH diaphorase and von Willebrand factor (vWF) expression. Thus, suggesting that annuli endothelial cells are able to induce vasodilatation and to maintain an antithrombotic milieu. Smooth muscle cells in the annuli appeared reoriented embracing the origin of the collateral arteriole. This particular disposition could indicate a sphincter-like activity by bulging annuli cells to the arteriolar lumen. In addition, ultrastuctural analysis evidenced the existence of peg-and-socket junctions between smooth muscle cells of arteriolar annuli. This result suggests a stretch-coordinated annuli contraction. Furthermore, a possible reinforcement of basement membrane was evidenced by increased expression of its main components, including collagen IV, laminin and fibronectin. A diminished colocalization of collagen IV and laminin, suggest a change in the organization of basement membrane in arteriolar annuli. ICs have been described as a new cell population in the arteriolar annuli. These cells showed features matching the "gold standard" ultrastructural features established for the intestinal Interstitial Cajal cells identification. In addition, annuli presuntive Interstitial Cajal cells expressed specific markers of these cells, such as Ano1 and CD44, although c-kit expression could not be observed. A distinctive pattern of distribution of F-actin filaments, together with an increased expression of -actin and a lack of -SMA allowed further differentiation between annuli ICs and vascular smooth muscle cells. Functional studies suggest that annuli ICs perform functions of: pacemarker activity, neuromodulation and mechanotransduction. Blood flow alteration is an early event in retinal diseases, such as diabetic and hypertensive retinopathies, which are the two major causes of blindness and visual impairment worldwide. Thus, the function of arterial annuli and their alterations during retinopathy could be of interest in order to understand the physiopathology of vascular retinopathy. The analyisis of arteriolar annuli in model of diabetes type II (db/db mice) evidenced impaired glycogen storage in annuli ICs. In addition, the studies in a model of hypertension (KAP transgenic mice) evidenced a decreased expression of Ano1 in annuli ICs during hypertensive retinopathy, suggesting a loss of function of calcium-activated chloride channels. Thus, alterations observed in the retinal ICs could induce an impaired function of arteriolar annuli driving to dysregulation of blood flow during retinopathy. Moreover, arterial annuli are present in man retina. Preliminary results, as happens in mice, may suggest its alteration during retinopathy Taken together, obtained results suggest that arteriolar annuli are endowed with specific molecular, structural and functional characteristics which allow playing a key role in the retinal blood flow regulation in health and during retinopathy