ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DO NÚMERO DE CÓPIAS NA EXPRESSÃO DO GENE BLAKPC EM ISOLADOS CLÍNICOS DE MORGANELLA MORGANII E PROVIDENCIA STUARTII

Introdução/Objetivo: Organismos produtores de Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) são desafiadores em termos terapêuticos e diagnósticos, pois comumente apresentam resistência a todos os beta-lactâmicos. Além disso, esse determinante possui rápida disseminação pela localização do gene blaKPC em plasmídeos transferíveis e transposons. Por esta razão, estudos sugerem que o gene blaKPC pode apresentar diferentes níveis de expressão, bem como variação no número de cópias, influenciando diretamente nos níveis de resistência aos carbapenêmicos. Um fenótipo atípico de susceptibilidade aos carbapenêmicos apresentado por isolados da tribo Proteeae que abrigavam o gene blaKPC motivou este trabalho, que analisou a influência do número de cópias na expressão do gene blaKPC. Métodos: O DNA genômico dos isolados bacterianos foi extraído a partir do kit Wizard™ Genomic DNA Purification. Os genes utilizados como controles endógenos foram selecionados a partir da literatura. Os primers foram desenhados para ambas as espécies bacterianas e posteriormente analisados in sílico. A quantificação absoluta, foi baseada na proporção relativa entre gene alvo e controle endógeno (2-DCq), utilizando equipamento StepOneTM (Applied Biosystems) e o fluoróforo SYBR® Green. Os experimentos de quantificação absoluta foram realizados com o gene alvo, blaKPC, e com os genes de controle endógenos (tufMm, tufPs, tufKp e HKEc). Resultados: As amplificações do gene blaKPC ocorreram no mesmo ciclo de quantificação ou com diferença ≤2 nos isolados analisados, tanto nos isolados clínicos (Mm01 = 13,027; Ps28 = 13,687; Kp125 = 14,74), quanto nos respectivos isolados transformantes (TMm01 = 14,584; TPs28 = 15,807; TF125 = 14,135). As amplificações dos genes controles endógenos se mostraram estáveis e eles foram utilizados para normalizar os dados. A quantificação absoluta relativa do gene blaKPC foi menor ou igual a 2 em todos as linhagens analisadas, indicando que não há diferença significativa no número de cópias entre eles. Conclusão: Apesar dos distintos perfis fenotípicos observados, os dados de quantificação absoluta demonstraram que o número de cópias do gene blaKPC para os isolados transformantes e para os isolados clínicos não variam significativamente, portanto algum mecanismo a nível de regulação transcricional deve estar atuando na expressão do gene blaKPC, influenciando diretamente os níveis de resistência

GENES DE REFERÊNCIA PARA ESTUDOS DE EXPRESSÃO RELATIVA POR QPCR EM ISOLADOS DE KLEBSIELLA PNEUMONIAE

Introdução/Objetivo: Isolados de Klebsiella pneumoniae resistentes à multiplas drogas têm sido extensivamente reportados em todo o mundo. Alguns determinantes de resistência tornaram-se mais preocupantes pela sua disseminação, como o gene blakpc, já reportado em cepas com altos níveis de resistência aos carbapenêmicos. Em determinados contextos, esse fenômeno é atribuído a mecanismos adicionais, como por exemplo, a regulação da expressão desse gene. Esse trabalho avaliou a estabilidade da expressão de genes candidatos a controles endógenos em K. pneumoniae para aplicação em estudos de expressão relativa por qPCR. Métodos: Foram pré-selecionados vinte e um pares de iniciadores candidatos a controles endógenos, submetidos a análises in sílico, avaliando-se: amplificação nos principais grupos clonais de K. pneumoniae; tamanho do fragmento; temperatura de melting e formação de estruturas secundárias. Os primers foram validados pelo método de curva padrão. O RNA foi extraído usando TRIzol® e o cDNA, sintetizado com o Kit EasyScript™. As reações de qPCR foram realizadas no equipamento StepOneTM, com o fluoróforo SYBR® Green. Foram utilizados isolados clínicos com distintos perfis de susceptibilidade aos carbapenêmicos para testar a estabilidade dos genes frente a exposição com antimicrobiano. Os dados foram analisados no software BestKeeper. Resultados: Os primers para os genes proC, rpoC, rho, tuf e rpoB foram validados. Após análises no BestKeeper, os genes rpoC, rpoB, proC e rho, foram categorizados como os mais estáveis. A expressão relativa do gene blaKPC, normalizada com os distintos controles endógenos, mostrou resultados semelhantes, indicando que os genes selecionados são bons normalizadores para estudos de expressão. O isolado com maior concentração inibitória mínima (CIM) para os carbapenêmicos, apresentou maiores níveis de expressão quando comparado ao isolado com menor CIM, utilizando os genes rpoC, rpoB e proC como controles endógenos. Conclusão: Evidencia-se a importância de avaliar criteriosamente os primers descritos na literatura como etapa anterior às análises de expressão relativa, pois a estabilidade dos genes está associada a condição imposta nas análises e pode gerar resultados não-válidos, além de equívocos de entendimento dos fenótipos. Estudos de estabilidade dos genes de controles endógenos em distintas condições são de suma importância para a confiabilidade dos resultados de qPCR

EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE KLEBSIELLA PNEUMONIAE MULTIDROGA RESISTENTE EM HOSPITAIS TERCIÁRIOS NO ESTADO DE PERNAMBUCO

Introdução/Objetivo: Klebsiella pneumoniae é um patógeno oportunista, responsável por causar diversas infecções relacionadas a assistência à saúde. A disseminação de cepas dessa espécie com fenótipo de resistência a múltiplas drogas, tornou-se uma ameaça global, o que faz da vigilância epidemiológica uma abordagem crítica para estimar e combater este fenômeno. Esse estudo analisou os mecanismos de resistência e disseminação de isolados clínicos de K. pneumoniae do estado de Pernambuco, Brasil. Métodos: Os isolados foram coletados em dois hospitais da rede pública de saúde de Pernambuco localizados no Sertão e na região metropolitana do Recife, durante 12 meses. A relação filogenética foi analisada por ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus – Polymerase Chain Reaction) e as sequências tipo foram determinadas por Multi Locus Sequence Typing (MLST). Os padrões de ERIC foram analisados pelo software PyElph e agrupados por Neighbor Joining. Os determinantes de resistência aos betalactâmicos, quinolonas e aminoglicosídeos foram investigados por PCR convencional e, posteriormente, sequenciados para determinação do perfil alélico e análise de mutações em genes constitutivos associados à resistência a essas drogas. As proteínas de membrana externa (OMPs) das cepas resistentes às cefalosporinas e carbapenêmicos foram avaliadas por SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis). Resultados: As análises moleculares de 49 isolados de K. pneumoniae indicaram uma disseminação policlonal de cepas resistentes, de Sequence Types mundialmente disseminados, como ST15 e ST11, carreando mecanismos de resistência aos betalactâmicos, aminoglicosídeos e quinolonas. Genes que codificam determinantes de resistência às penicilinas e cefalosporinas, como as betalactamases blaTEM, blaSHV e blaCTX e aos carbapenêmicos (blaKPC-2 e blaNDM-1), foram predominantes. A resistência às quinolonas nos isolados foi mediada por mutações na Região Determinante de Resistência à Quinolonas dos genes gyrA e parC e pela presença de genes plasmidiais qnrB-1 e qnrS-6. A análise das OMPs por SDS-PAGE indicou uma menor produção de OmpK36 nas cepas resistentes a pelo menos um carbapenêmico. Conclusão: A predominância policlonal de bactérias resistentes no ambiente hospitalar, oportuniza a disseminação horizontal da resistência e o surgimento de linhagens com acúmulo de mecanismos, sinalizando para falhas nas práticas de higienização das unidades de saúde