Microarray-basierte genotypische Resistenzbestimmung in HIV

Eines der Hauptprobleme der antiviralen Therapie ist das Entstehen resistenzassoziierter Mutationen. Der Nachweis solcher Mutationen ist für eine erfolgreiche Therapie eine entscheidende Voraussetzung. In dieser Arbeit wurde ein Microarray zur Detektion von relevanten Mutationen innerhalb der Protease (PR) und –Reversen Transkriptase (RT) des humanen Immundefizienzvirus (HIV) entwickelt und validiert. Als zeit und kostengünstigere Alternative zur routinemäßig eingesetzten Sanger-Sequenzierung wurde die Arrayed Primer Extension (APEX)-Methode zur genotypischen Resistenzbestimmung etabliert. Zur Abfrage von 26 resistenzassoziierten Codons innerhalb der PR- und 33 Codons innerhalb der RT-kodierenden Region wurden Oligonukleotide erstellt. Aufgrund der enormen Variabilität des HIV Genoms berücksichtigen diese alle Sequenzvarianten, die mit einer Frequenz von >5% (PR) bzw. >10% (RT) in der Los Alamos Datenbank verzeichnet sind. Um diese Sequenzabdeckung technisch und finanziell zu realisieren, wurde die Verwendung degenerierter Oligonukleotidsonden für APEX etabliert. Für die Validierung des PR und RT Microarrays wurden 94 bzw. 48 PCR Produkte aus Patientenproben mit bekannter Sequenz analysiert. Dafür wurden die APEX-Reaktionsbedingungen erfolgreich angepasst. Die Vergleichssequenzen wurden durch Sanger-Sequenzierung ermittelt. 93% (PR) bzw. 88% (RT) aller untersuchten Positionen wurden mittels APEX übereinstimmend bestimmt. Der Anteil an Positionen, für die aufgrund schwacher Signalintensitäten keine Sequenzzuweisung vorgenommen werden konnten, liegt bei 3% (PR) und 5% (RT). Es wurde gezeigt, dass dieses Ergebnis durch Optimierung der Sonden deutlich verbessert wird. Die zufällig ausgewählten Proben umfassten sowohl HIV-Subtyp B als auch nicht Subtyp B Sequenzen. Aufgrund der verwendeten Sonden ist die Übereinstimmung für die untersuchten Subtyp B Proben im Vergleich mit den nicht Subtyp B Proben höher (94% / 88% für PR; 88% / 84% für RT). Sequenzmischungen wurden qualitativ gut detektiert, eine Quantifizierung ist aber Sonden-abhängig. Der Fehlerbereich ist vergleichbar mit dem anderer Genotypisierungsmethoden. Das entwickelte Testverfahren kann kostengünstig mit hohem Probendurchsatz durchgeführt werden. Parallel zur HIV-Genotypisierung wurde anhand zweier Beispiele gezeigt, dass auch Mutationen im Wirtsgenom, die mit der Krankheitsprogression assoziiert sind, sehr gut mittels APEX nachgewiesen werden können. Dies wird künftig eine sinnvolle Ergänzung des Microarrays sein und eine individuellere Therapie ermöglichen

Pancreatic Cancer Susceptibility Loci and Their Role in Survival

Pancreatic cancer has one of the worst mortality rates of all cancers. Little is known about its etiology, particularly regarding inherited risk. The PanScan project, a genome-wide association study, identified several common polymorphisms affecting pancreatic cancer susceptibility. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in ABO, sonic hedgehog (SHH), telomerase reverse transcriptase (TERT), nuclear receptor subfamily 5, group A, member 2 (NR5A2) were found to be associated with pancreatic cancer risk. Moreover the scan identified loci on chromosomes 13q22.1 and 15q14, to which no known genes or other functional elements are mapped. We sought to replicate these observations in two additional, independent populations (from Germany and the UK), and also evaluate the possible impact of these SNPs on patient survival. We genotyped 15 SNPs in 690 cases of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) and in 1277 healthy controls. We replicated several associations between SNPs and PDAC risk. Furthermore we found that SNP rs8028529 was weakly associated with a better overall survival (OS) in both populations. We have also found that NR5A2 rs12029406_T allele was associated with a shorter survival in the German population. In conclusion, we found that rs8028529 could be, if these results are replicated, a promising marker for both risk and prognosis for this lethal disease

Genotypic resistance testing in HIV by arrayed primer extension

The analysis of mutations that are associated with the occurrence of drug resistance is important for monitoring the antiretroviral therapy of patients infected with human immunodeficiency virus (HIV). Here, we describe the establishment and successful application of Arrayed Primer Extension (APEX) for genotypic resistance testing in HIV as a rapid and economical alternative to standard sequencing. The assay is based on an array of oligonucleotide primers that are immobilised via their 5′-ends. Upon hybridisation of template DNA, a primer extension reaction is performed in the presence of the four dideoxynucleotides, each labelled with a distinct fluorophore. The inserted label immediately indicates the sequence at the respective position. Any mutation changes the colour pattern. We designed a microarray for the analysis of 26 and 33 codons in the HIV protease and reverse transcriptase, respectively, which are of special interest with respect to drug resistance. The enormous genome variability of HIV represents a big challenge for genotypic resistance tests, which include a hybridisation step, both in terms of specificity and probe numbers. The use of degenerated oligonucleotides resulted in a significant reduction in the number of primers needed. For validation, DNA of 94 and 48 patients that exhibited resistance to inhibitors of HIV protease and reverse transcriptase, respectively, were analysed. The validation included HIV subtype B, prevalent in industrialised countries, as well as non-subtype B samples that are more common elsewhere