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    Caracterización molecular de bacterias cultivables y no cultivables procedentes de pozas de lixiviación con cianuro

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    In the present study, bacterial communities in soil and water samples, from artisanal leaching pools with cyanide, were characterized by dependent and independent culture analyzes. For the characterization of the culturable bacterial community, classical techniques of microbiology were used, until obtaining pure strains, which were identified at the molecular level. On the other hand, uncultured bacterial communities were characterized by next-generation sequencing of the 16S rRNA gene. The culturable bacterial community was mainly represented by the genera Pseudomonas, Bacillus and Acinetobacter; while the predominant uncultured communities, in soil samples, were the proteobacteria (12.91%), Firmicutes (11.32%), Actinobacteria (11.25%) and Bacteroidetes (10.16%). On the other hand, in water samples, the edges of Firmicutes (59.16%) and Actinobacteria (38.99%) predominated.En el presente estudio, las comunidades bacterianas en muestras de suelo y agua, procedentes de pozas artesanales de lixiviación con cianuro, fueron caracterizadas por análisis dependientes e independientes de cultivo. Para la caracterización de la comunidad bacteriana cultivable, se emplearon técnicas clásicas de microbiología hasta la obtención de cepas puras, las cuales fueron identificadas a nivel molecular. Por otro lado, las comunidades bacterianas no cultivables fueron caracterizadas por secuenciación de próxima generación del gen ARNr 16S. La comunidad bacteriana cultivable estaba principalmente representada por los géneros Pseudomonas, Bacillus y Acinetobacter; mientras que las comunidades no cultivables, predominantes en muestras de suelo, fueron los filos Proteobacteria (12.91%), Firmicutes (11.32%), Actinobacteria (11.25%) y Bacteroidetes (10.16%). Por otro lado, en muestras de agua predominaron los filos Firmicutes (59.16%) y Actinobacteria (38.99%)

    Caracterización molecular de los microorganismos presentes durante el proceso fermentativo de los granos de cacao (Theobroma cacao)

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    Cocoa beans fermentation is a spontaneous process of post-harvest very important for the development of chocolate aroma and flavor, which involves a number of complex microbial activities. In this work, we identify the microorganisms present in cocoa beans before, during and after the fermentation process, applying DNA sequencing analysis and MALDI TOF / TOF mass spectrometry. With the first method, the predominant bacteria and yeast identified were Lactobacillus plantarum (29%), L. brevis (18%), Bacillus cereus (15%), Pediococcus acidilactici (12%), and Pichia kudriavzevii (100%). The most important peptide sequences of each identified strain by mass fingerprint were characterized too. By the second method, 51 species of microorganisms being 73.7% bacterial species and 26.3% yeast species were identified. Additionally peptide sequences responsible Vicilin protein characteristic aroma of the fermented cocoa beans and the albumin protein of 21KDa were detected.La fermentación de granos de cacao es un proceso espontáneo de post cosecha muy importante para el desarrollo de aroma y sabor a chocolate el cual involucra un sin número de actividades microbianas complejas. En el presente estudio se identifican los microorganismos presentes en granos de cacao antes, durante y después del proceso de fermentación aplicando dos métodos: el análisis de secuenciamiento de ADN y la espectrometría de masas MALDI TOF/TOF. Dentro del grupo de bacterias y levaduras predominantes identificadas por el primer método se encontro a Lactobacillus plantarum (29%), L. brevis (18%), Bacillus cereus (15%), Pediococcus acidilactici (12%), y Pichia kudriavzevii (100%). Asimismo se caracterizó por huella de masas las secuencias peptídicas más importantes de cada cepa identificada. Por otro lado, aplicando el segundo método, se identificaron 57 especies de microorganismos, siendo el 73.7% especies bacterianas y el 26.3% especies de levaduras. Adicionalmente se detectaron secuencias peptídicas de la proteína vicilina responsable del aroma característico de los granos de cacao fermentados y a la proteína albumina de 21KDa

    Endosymbiont microbiota of meloidogyne javanica adult female infected by pasteuria penetrans

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    Antecedentes: Pasteuria penetrans es una bacteria no cultivable que parasita obligadamente a varias especies de nemátodos fitopatógenos. Factores endógenos reproductivos femeninos, vegetales o microbianos desconocidos son indispensables para la multiplicación y formación de endosporas de P. penetrans. Objetivo: Caracterizar las endosporas de P. penetrans mediante la secuenciación del gen 16S ARNr en muestras de hembras adultas de Meloidogyne javanica infectadas y microbiota de hembras adultas de M. javanica infectadas y no infectadas con P. penetrans mediante secuenciamiento de alto rendimiento de la región hipervariable V4 del gen 16S ARNr. Metodología: Se colectaron las raíces infectadas de viñedos, se extrajo nemátodos juveniles (J2) infectivos frescos para fijación de endosporas de P. penetrans y su inoculación en plantas de tomate. El ADN genómico y metagenómico de hembras adultas de M. javanica infectadas y no infectadas se extrajo para su secuenciamiento a partir de la región V4 del gen 16S ARNr de P. penetrans y su microbioma bacteriano. Las secuencias generadas fueron procesadas mediante software bioinformáticos para los análisis de índices de alfa y beta diversidad del microbioma bacteriano. Resultados: Se obtuvo un amplicón de 550 pares de bases con 98% identidad y homología a P. penetrans. El perfil taxonómico reveló la mayor diversidad y riqueza bacteriana en la microbiota relacionada a hembras adultas infectadas, siendo Proteobacteria la que se presentó en ambas muestras entre 45 al 83%, seguido de Firmicutes, Actinobacteria y Bacteroidetes con 19, 11 y 8% respectivamente a nivel de filo. Asimismo, se identificó géneros más abundantes asociados a la microbiota nativa del nemátodo adulto tales como Pseudomonas, Flavobacterium y Chitinophaga al 82,5, 15 y 2% respectivamente. En las hembras infectadas se registró a Paenibacillus, Pasteuria, Pseudomonas y Streptomyces con el 45, 7, 6 y 5% respectivamente, los más abundantes. Implicaciones: Los resultados sugieren la existencia géneros bacterianos en hembras de M. javanica infectadas involucrados en el desarrollo in vivo de endosporas de P. penetrans. Conclusiones: Esto revelaría una reducción del dominio de Pseudomonas favoreciendo la colonización de diferentes bacterias que cohabitan con P. penetrans, siendo este cambio en la composición microbiana un posible factor que favorece la multiplicación de endosporas de P. penetrans dentro del hospedero

    Identification of effecting proteins by MALDI TOF/TOF mass spectrometry of the root-knot nematode Meloidogyne javanica

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    La principal problemática del cultivo de vid son los nematodos agalladores de la raíz causan serios problemas en el rendimiento en la mayoría de cultivos en todo el mundo. A través de sus diferentes mecanismos de infección estos nematodos sintetizan y secretan una mezcla de efectores a base de compuestos proteicos que utilizan para penetrar la raíz, migrar y desarrollarse en células gigantes de alimentación radicular en las plantas hospederas. El uso de nuevas herramientas moleculares como la espectrometría de masas MALDI TOF/TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time-Of-Flight) y la técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) han permitido conocer estas proteínas y genes en diferentes microorganismos. Objetivo: Caracterizar al nematodo agallador de la raíz Meloidogyne javanica mediante la secuenciación del gen ARNr 18S a partir de muestras radiculares infectadas y las proteínas efectoras de juveniles (J2) y adultas (J4) estadio de M. javanica mediante la espectrometría doble masa MALDI TOF/TOF de tipo shotgun proteomics. Metodología: Las raíces infectadas del cultivo de vid fueron colectadas para extraer agallas y J2 frescos de M. javanica, posteriormente se inocularon en plantas de tomate. Se utilizaron J4 de M. javanica para la extracción del ADN genómico y su secuenciamiento a nivel del gen ARNr 18S. Los estadios J2 y J4 de M. javanica, se desinfectaron con hipoclorito de sodio (0,5%) y agua destilada estéril, para la extracción y análisis de proteínas con MALDI-TOF/TOF. Por último, las secuencias obtenidas fueron procesadas con los softwares ProteinPilot™ y Protein BLAST para la identificación de proteínas efectores de M. javanica. Resultados: Se identificó molecularmente, a través de la amplificación por PCR del gen ADNr 18S al nemátodo M. javanica con un porcentaje de identidad de 98% a partir de muestras radiculares infectadas y mediante espectrometría de masas MALDI TOF/TOF, se identificaron secuencias proteicas efectoras tales como: Beta-1,4-endoglucanas y polygalaturonasa, identificadas a partir de J2, y la expansin B2, CLAVATA3/ESR, Pectato lyasa y Chorismato mutasa a partir de J4, involucradas en los diversos procesos de infección. Además, se lograron identificar 49 proteínas no efectoras del nematodo en ambos estadios relacionadas al desarrollo biológico conservado. Implicaciones: Los resultados indican la existencia de proteínas efectoras relacionadas a la formación de agallas de la raíz. Conclusiones: Este estudio confirman que la metodología de espectrometría de doble masa proporciona de una forma rápida y reproducible un perfil proteómico que el nematodo agallador sintetiza para infectar las células radiculares y que puede ser usado en otros tipos de patógenos

    Assessment of Heterotrophic Nitrification Capacity in Bacillus spp. and its Potential Application in the Removal of Nitrogen from Aquaculture Water

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    The accumulation of nitrogen (-N) is a serious problem in aquaculture as it could lead to mass mortality events of the cultivated species. Chemilitotrophic nitrification is the most recognized in nitrogen removal underestimating the role of heterotrophic nitrifiers. In the present study, the heterotrophic nitrification capacity of 8 bacterial strains isolated from mangrove soil, periphyton and biofilters was evaluated. The strains were grown in heterotrophic nitrification base medium (HNM medium) with three different nitrogen sources, ammonium, nitrite or nitrate at a final concentration of 8 mg L-1, 5 mg L-1 and 80 mg L-1 respectively. The concentration of nitrogen (-N) and OD (600 nm) were determined periodically. Only in 4 strains belonging to the Bacillus genus was the capacity for heterotrophic nitrification and aerobic denitrification observed. Among these strains, SM4 strain presented a good removal profile of ammonium, nitrite and nitrate, achieving an average nitrification efficiency of 98.33 ± 2.89%, 83.67 ± 7.51% and 98.00 ± 0.01% respectively, and a nitrification rate (mg L-1 h-1) of 1.71 ± 0.70, 0.13 ± 0.07 and 0.21 ± 0.06 respectively. The nxrB, nirS, nirK genes in the selected strains were identified by PCR. Additionally, several proteins (enzymes) involved in the nitrogen cycle were identified by proteomic analysis, reporting for the first time the presence of the enzymes ammonia monoxygenase (AMO) and nitrite oxide reductase (NXR) in the genus Bacillus. These findings suggest that the strains studied would have a potential use in the biological removal of nitrogen in aquaculture systems
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