Understanding the disease and supporting clinical decisions

Barrett’s esophagus (BE) is a recognized premalignant condition of the distal esophagus that constitutes the major risk factor for the development of esophageal adenocarcinoma (EA). Despite the known low rates of BE progression to EA, the incidence of both has increased profoundly over the last decades and esophageal malignancy remains to be a deadly cancer with high morbidity and mortality unless diagnosed at early stages. Current BE clinical management has revealed unsuccessful in reverting this worrisome epidemiological picture and a major hurdle has been the incapacity to discriminate among BE patients those who have a higher risk of malignant progression. In fact, to this date, besides dysplasia none of the existing clinical and histologic criteria could anticipate malignant progression. It is therefore imperative to find reliable molecular biomarkers to guide medical practice and improve the standard of care for BE patients. The global aim of this thesis was to better understand the pathways underlying BE malignant progression and thereby identify reliable biomarkers relevant for the diagnosis, prognosis and management of BE patients thus contributing to an improved understanding of BE biology and an optimized support for clinical decisions. To accomplish these challenging goals an unbiased and a hypothesis-driven strategies were followed. Through the unbiased approach, a meta-analysis of transcriptome datasets and subsequent experimental validation in a cohort BE patients in follow-up was used to define a gene set associated with BE cancer development and, therefore, identify early biomarkers predictive of BE malignant progression. In silico analysis singled out two genes, CYR61 and TAZ as candidate predictive markers for BE malignant progression and experimental validation using quantitative PCR and immunohistochemistry revealed that both genes are upregulated and overexpressed in non-dysplastic BE index biopsies from progressors years before cancer development when compared with index biopsies from BE patients that did not progressed. We also found that EMT and stemness-related genes were also significantly over represented in BE associated with progression. Together, these results support that CYR61 and TAZ are promising early biomarkers to stratify BE patients according to their cancer risk and suggest a novel mechanist route for BE neoplastic progression. Using an hypothesis-driven approach, we explored when and how centrosome abnormalities arise along BE malignant pathway, from the early premalignant condition stage to metastatic disease, by establishing an accurate method to identify and score centrosomes, at the single-cell level, in patient samples and cell lines. We found that centrosome amplification arises as early as the premalignant condition of patients that progress to malignancy and significantly expands at dysplasia stage, which is dependent of p53 loss of function, being then present along cancer progression, namely in EA and metastasis. So, these finding suggest that centrosome amplification could contribute to BE initiation and malignant progression. Considering that centrosome amplification is specific of patients that progress to cancer, this could be further explored to be translated into useful tools to be used in the clinical setting and potentially improve its diagnosis, prognosis and treatment. Moreover, given widespread occurrence of both p53 mutations and centrosome abnormalities in human tumors, our findings are likely to be extended to other cancers. Collectively, both research avenues suggest the existence of different cellular and molecular abnormalities dictating different pathological propensity for malignant progression in BE, right from the beginning, and this could be further explored to trace a cancer risk profile for every patient and guide medical decisions and improve patient care.O esófago de Barrett (EB) é uma reconhecida condição pré-maligna que surge no esófago distal associada ao refluxo gastroesofágico crónico e constitui o maior factor de risco para o desenvolvimento do adenocarcinoma esofágico (AE). Apesar da taxa de progressão maligna do EB ser baixa, a incidência de ambos tem aumentado drasticamente nas últimas décadas. Como agravante, esta neoplasia em estadios avançados está associada a taxas elevadas de morbilidade e mortalidade a menos que diagnosticada e tratada em estadios iniciais, pelo que todos os doentes com EB são integrados em programas de vigilância com vista à detecção precoce de progressão neoplásica. Contudo, esta prática clínica tem-se mostrado ineficaz para reverter este cenário epidemiológico e um dos factores limitantes relaciona-se com o facto da displasia continuar a ser o único marcador de risco de progressão maligna e não haver marcadores moleculares e clínicos que possam predizer e estratificar o potencial maligno do EB. É assim urgente encontrar biomarcadores sensíveis e específicos capazes de guiar a prática médica, melhorar a relação custo-benefício dos programas de vigilância, mas principalmente a qualidade de vida dos doentes com EB. O objectivo principal desta tese foi descobrir novas vias moleculares subjacentes à progressão maligna do EB de forma a identificar biomarcadores fidedignos passíveis de serem aplicados à clínica apoiando o diagnóstico, prognóstico e manejo destes doentes, e assim contribuir para aprofundar o conhecimento relativo ao processo de cancerigénese desta doença e potencialmente melhorar a abordagem clínica aos doentes com EB. Para tal foram seguidas duas linhas de investigação diferentes. De modo a encontrar biomarcadores com potencial preditivo para progressão maligna em doentes com EB foi realizada uma meta-análise de dados de transcriptomas previamente publicados, seguida de uma validação experimental utilizando amostras de EB de doentes acompanhados no programa de vigilância do Instituto Português de Oncologia Francisco Gentil. Esta estratégia permitiu identificar dois promissores biomarcadores, o CYR61 e o TAZ, capazes de estratificar o risco de progressão maligna do EB, não só pela sua expressão diferencial ser a mais significativa na análise bioinformática mas porque a validação experimental revelou que estes dois genes se encontravam sobreexpressos logo na primeira biopsia (vários anos antes do desenvolvimento de cancro) onde foi feito o diagnóstico de EB dos doentes que progrediram comparativamente com a expressão detetada no EB dos não progressores. Adicionalmente, foram ainda identificados outros genes diferencialmente expressos em EB associados a progressão maligna, cujas funções estão associadas a fenótipos de células estaminais e fenómenos de transição epitélio-mesenquimal (TEM) em cancro. Assim, foi também descoberto um potencial novo processo molecular associado ao desenvolvimento de cancro em EB. Paralelamente, e considerando que alterações numéricas dos centrossomas podem estar presentes ao longo da progressão maligna em EB e assim contribuir para o seu processo de cancerigénese, decidimos explorar quando e como surgem as alterações numéricas dos centrossomas ao longo da progressão do EB, desde a condição prémaligna até às metástases ganglionares, tanto em amostras de doentes como em linhas celulares, usando um método de dupla marcação por imunofluorescência para identificar e quantificar fidedignamente o número de centrossomas por célula. Esta análise revelou a existência de células com centrossomas supranumerários logo na fase de metaplasia dos doentes que progrediram para cancro, e que a sua incidência aumenta significativamente na fase de displasia, a qual é dependente da perda de função do gene supressor tumoral p53, estando também depois presentes ao longo das restantes fases de progressão. Estes resultados sugerem assim que a desregulação dos centrossomas pode contribuir para a iniciação e progressão neoplásica do EB. No futuro será importante aprofundar o contributo dos centrossomas na cancerigénese do EB e tentar perceber qual o seu impacto no diagnóstico, prognóstico e tratamento destes doentes. Uma vez que tanto as alterações numéricas dos centrossomas como a perda de função do p53 são achados prevalentes em cancro, os resultados deste estudo poderão ser relevantes para outros modelos tumorais. Em conjunto, os resultados obtidos sugerem que a propensão maligna não é igual em todos os EB. Logo muito cedo no processo, aqueles cujo risco de virem a desenvolver cancro é maior sofrem alterações moleculares e celulares passíveis de serem detetadas e utilizadas como biomarcadores preditivos estratificando o risco de progressão maligna, e desta forma orientar as decisões clínicas, adequar tempos de vigilância e melhorar a abordagem terapêutica