Strukturelle Analyse des Enzyms N-Formylmethanofuran:Tetrahydromethanopterin-Formyltransferase

Archaea represent a third domain of life and some archaea exhibit a high degree of tolerance to extreme environmental conditions. Several members are methanogens and present in many anaerobic environments. Most methanogens are able to maintain growth simply on H2 and CO2 via the enzymatically catalyzed reaction 4H2 + CO2 > CH4 + 2 H2O. The archaeon Methanopyrus kandleri grows optimally at temperatures of 84°C to 110°C, pH values of 5.5 to 7.0 and NaCl concentrations 0.2% to 4%. The enzyme N-formylmethanofuran tetrahydromethanopterin formyltransferase (MkFTR) catalyzes the transfer of a formyl group from the cofactor N-formylmethanofuran (FMF) to the cofactor tetrahydromethanopterin (H4MPT), the second step of the above reaction. X-ray crystallographic analysis yielded insights into the structure and function of MkFTR, (1) the MkFTR monomer exhibits a pseudo-two fold structure suggestive of an evolutionary gene duplication. (2) The structure is a D2 homo-tetramer with prominent cleft-like surface features. Analysis of the interface contacts showed that the tetramer is best described as a dimer of dimers. The clefts were associated with the monomer:monomer interface and were weakly occupied by extra electron density which might be attributed to the H4MPT analog folate. (3) This suggested that the clefts are active sites and their association with oligomer interfaces suggested a basis for the dependence of activity on oligomerization. (4) The thermal stability of MkFTR most likely arises from the greater number of H- and ionic-bonds within the monomer and between monomers with respect to mesophilic protein structures. (5) The structure showed a large number of surface exposed negatively charged, glutamate and aspartate residues. These residues explain the salt dependent oligomerization, as only at high enough salt concentration is the electrostatic charge compensated by cation binding and neutralized allowing oligomerization. (6) These residues also improve the solubility of MkFTR at high salt concentration by increased charge repulsion. (7) Comparison of MkFTR structures from low and hight salt conditions showed that surface glutamate residues bind slightly more water molecules at high salt conditions further contributing to MkFTR solubility at high salt concentration.Eine kleine Gruppe von Organismen, die Methanogene, sind fähig, Methan zu erzeugen. Diese Gruppe von Organismen gehört ausschließlich der Domäne der Archaea an. Methanogene sind unter mesophilen, thermophilen, hyperthermophilen und halophilen Archaea vertreten. Das methanogene Archaeon Methanopyrus kandleri wurde in der Umgebung einer hydrothermalen Tiefseequelle entdeckt und wächst optimal bei Temperaturen zwischen 84°C und 110°C und bei pH-Werten von 5,5 bis 7,0 und NaCl-Konzentrationen zwischen 0,2% und 4%. Bis auf wenige Ausnahmen sind Methanogene in der Lage, auf Wasserstoff und Kohlendioxyd als einzigen Energiesubstraten zu wachsen und die Reaktion 4H2 + CO2 > CH4 + 2H2O zu katalysieren. Andere mögliche Substrate sind zum Beispiel Acetat und Methanol. Schritt 2: der Transfer einer Formylgruppe von FMF auf den Folate-ähnlichen Cofaktor Tetrahydromethanopterin (H4MPT) wird von der N-Formylmethanofuran:Tetrahydromethanopterin-Formyltransferase (FTR) durchgeführt. Ziel dieser Arbeit war die kristallografische Aufklärung der Proteinstruktur der FTR aus dem extrem thermophilen und salztoleranten Archaeon Methanopyrus kandleri (MkFTR). Die Bestimmung und die Analyse der Struktur könnte die strukturelle Basis der enzymatischen Aktivität und die Basis der extremen Thermostabilität und Salztoleranz der Enzyme erklären. Erstes Ergebnis dieser Arbeit war der Ausbau der MkFTR- Struktur aus Kristallform P, also PEG8000, als Fällungsmittel. Die Struktur besteht aus vier identischen Ketten pro asymmetrischer Einheit. Die Ketten bilden ein Tetramer mit D2-Symmetrie. Die unterschiedliche Größe der Kontaktfläche zwischen verschiedenen Monomeren lässt das MkFTR-Tetramer eher als ein Dimer von zwei Dimeren bezeichnen. Eine genauere Betrachtung des Monomers führt zu dem Schluss, dass das MkFTR- Monomer trotz fehlender Sequenzhomologie aus zwei Domänen besteht, und dass die beiden Domänen eine ähnliche Faltung haben. Die Domänen konnten mit dem DALI-Server überlagert werden. Dieses Ergebnis deutet eine evolutionäre Genverdoppelung an. Die Oberfläche des MkFTR-Tetramers zeigt vier große, symmetrisch verteilte Spalten. Diese Spalten haben jeweils drei Abzweigungen und liegen zum Teil direkt auf der Grenzfläche zwischen MkFTR-Monomeren. Der Zusammenhang dieser Stellen mit der Grenzfläche zwischen Monomeren verweist auf eine mögliche strukurelle Erklärung des Zusammenhangs zwischen der Aktivität und dem Oligomerzustand des MkFTR-Enzyms. Ein weiteres Indiz dafür, dass die Stellen Substrate-bindend sind, liegt daran, dass eine zusätzliche Elektronendichte in diesen Stellen zu finden war. Die Elektronendichte lässt sich nicht als Wassermoleküle modellieren. Eine mögliche Alternative wäre Folat, vielleicht in Form von Tetrahydro- oder Dihydrofolat. MkFTR könnte dies als Substratanalog zu H4MPT nach der heterologen Proteinproduktion in E. coli binden. Die höhere thermische Stabilität von MkFTR liegt wahrscheinlich an einer höheren Zahl von Wasserstoff- und Ionenbrücken, sowohl innerhalb eines Monomers als auch zwischen den Monomeren. Die Zahl der Ionenbrücken pro Aminosäurerest liegt deutlich höher gegenüber dem Durchschnittswert für mesophile Proteine. Die MkFTR-Struktur zeigt eine große Anzahl an negativ geladenen Resten auf der Moleküloberfläche, die für die höhere Löslichkeit und salzabhängige Thermostabilität der MkFTR verantwortlich sind. Diese Eigenschaft ist auch für die salzabhängige Oligomerisierung der MkFTR verantwortlich, weil die elektrostatische Abstoßung der Monomere erst bei erhöhter Salzkonzentration kompensiert wird, indem sich also an der Oberfläche Kationen anbinden. Die molekulare Basis der Salztoleranz von MkFTR könnte durch den Vergleich von Strukturen erklärt werden, die unter verschiedenen Salzkonzentrationen gelöst werden. Daraufhin wurde die MkFTR bei hoher Salzkonzentration (1% PEG 8000, 1.2M (NH4)2SO4 kristallisiert, Kristallform S und die gelöste Struktur mit der Struktur aus niedriger Salzkonzentration, Kristallform P (22% PEG 8000, 0.3M (NH4)2SO4, verglichen. Die Struktur der MkFTR Kristallform S wurde mittels Molekular-Ersatz (MR) gelöst und verfeinert. Die asymmetrische Einheit enthielt zwei MkFTR Monomere. Weiterhin zeigt der Vergleich der MkFTR Kristallform P- und S-Strukturen, dass Glutamatreste in Kristallform S eine geringfügig höhere Anzahl von Wassermolekülen gegenüber Kristallform P binden, circa 1,5 mal so viele Wassermoleküle pro Glutamat. Die größere Anzahl von gebundenen Wassermolekülen könnte zu der höheren Löslichkeit der MkFTR bei erhöhter Salzkonzentration beitragen. Die zusätzlichen gebundenen Wassermoleküle könnten die Hydrationsschicht des Proteins erweitern und dadurch die hydrophobe Oberfläche effektiv minimieren. Dies würde dazu führen, dass die hydrophobischen Wechselwirkungen, also der “salting-out“-Effekt, reduziert, und die MkFTR-Löslichkeit bei hoher Salzkonzentration erhöht würde

Structural Basis for Dual-Inhibition Mechanism of a Non-Classical Kazal-Type Serine Protease Inhibitor from Horseshoe Crab in Complex with Subtilisin

Serine proteases play a crucial role in host-pathogen interactions. In the innate immune system of invertebrates, multi-domain protease inhibitors are important for the regulation of host-pathogen interactions and antimicrobial activities. Serine protease inhibitors, 9.3-kDa CrSPI isoforms 1 and 2, have been identified from the hepatopancreas of the horseshoe crab, Carcinoscorpius rotundicauda. The CrSPIs were biochemically active, especially CrSPI-1, which potently inhibited subtilisin (Ki = 1.43 nM). CrSPI has been grouped with the non-classical Kazal-type inhibitors due to its unusual cysteine distribution. Here we report the crystal structure of CrSPI-1 in complex with subtilisin at 2.6 Å resolution and the results of biophysical interaction studies. The CrSPI-1 molecule has two domains arranged in an extended conformation. These two domains act as heads that independently interact with two separate subtilisin molecules, resulting in the inhibition of subtilisin activity at a ratio of 1:2 (inhibitor to protease). Each subtilisin molecule interacts with the reactive site loop from each domain of CrSPI-1 through a standard canonical binding mode and forms a single ternary complex. In addition, we propose the substrate preferences of each domain of CrSPI-1. Domain 2 is specific towards the bacterial protease subtilisin, while domain 1 is likely to interact with the host protease, Furin. Elucidation of the structure of the CrSPI-1: subtilisin (1∶2) ternary complex increases our understanding of host-pathogen interactions in the innate immune system at the molecular level and provides new strategies for immunomodulation