Padrão de glicosilação da glicoproteína do vírus da raiva produzida em células drosophila melanogaster S2: diferentes sistemas de expressão e condições de cultivo tese

Rabies virus glycoprotein (RVGP) produced in animal cells had become an attractive alternative for development of a new vaccine against rabies with lower biosecurity risk and lower costs. In recombinant proteins production host cell lineage and cultivation parameters and conditions are important factors for glycoform profile of final protein, which impacts directly in its function. Objectives: Determine and compare the glycosylation pattern of rabies virus glycoprotein (RVGP) expressed in insect Drosophila melanogaster Schneider 2 (S2), in different expression systems and culture conditions. Methods: S2 cells expressing RVGP in cell membrane using inducible (S2MtRVGP-imm) or constitutive (S2AcRVGP-2) promoter, and expressing the soluble RVGP ectodomain, using an inducible promoter (S2BipMt_RVGP-Ecto), stablished in previous studies, were used in the present work. S2BipMt_RVGP-Ecto cells were cultivated in schott flasks and S2MtRVGP-imm cells were cultivated in schott and spinner flasks, in both cases with different induction parameters and cultivation time. S2AcRVGP-2 cells grown in bioreactor, in batch or fed-batch with glutamine supplementation. An immunoaffinity chromatography methodology for membrane rRVGP (rRVGP-S2Mt and rRVGP-S2Ac) were stablished using a commercial monoclonal antibody attached to a HiTrap NHSactivated HP (GE). Soluble ectodomain (rRVGP-S2Ecto) were purified by Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC-Ni+2). Glycosylation pattern were analyzed by hydrophobic interaction chromatography (HILIC) or by HILIC accoupled with a mass spectrometry (UPLC-FLR-MS/MS). Results: For S2BipMt_RVGP-Ecto cells, the variation in inductor concentration presented biological effect that reflected on cell growth and rRVGP production. Inductor concentration and cell concentration at induction resulted in an increase in rRVGP production speed by S2MtRVGP-imm cells. Cultivation on spinner flasks results in a higher production of rRVGP-S2Mt comparing with schott flasks cultivation. The strategy of low initial glutamine concentration with supplementation during the S2AcRVGP-2 cell cultivation decreased the ammonium formation after the end of exponential phase, with an impact on growth and rRVGP production. Immunoaffinity chromatography methodology purification generated samples with high level of purity and efficiency up to 99 % of trimeric rRVGP-S2Mt. For rRVGP-S2Ac the same methodology worked with less efficiency and low level of purity. IMAC-Ni+2 used for rRVGP-S2Ecto presented low level of purity due to the low amount of expressed glycoprotein. In glycan pattern analyzes, samples of rRVGP-S2Ecto presented in higher proportion paucimannosidic structures: F(6)M2, M3 and F(6)M3. In rRVGP-S2Mt samples, the structures F(6)M2 e M3 were detected in higher proportion. rRVGP-S2Ac samples presented higher proportion of structures M2, F(6)M2 e M3. Conclusions: Increase of inductor concentration and of cell concentration at induction time results in a biological effect, by increasing expression speed of rRVGP. Specific production speed of rRVGP has a direct influence on decrease of N-glycans processing. Furthermore, different cultivation modes resulted in variation in glycan pattern, and a drastic reduction in initial glutamine concentration resulted in an increase on glycoforms with five or more mannose residues.A glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) produzida em células animais tem se tornado uma alternativa atrativa para o desenvolvimento de uma nova vacina contra a raiva com menor risco de biossegurança e menor custo. Na produção de proteínas recombinantes, a escolha da linhagem celular hospedeira e os parâmetros e condições de cultivo são fatores particularmente importantes para o perfil de glicoformas da proteína final, que impacta diretamente na função esperada da proteína. Objetivos: Determinar e comparar o padrão de glicosilação da proteína do vírus da raiva (RVGP) expressa em células de inseto Drosophila melanogaster Schneider 2 (S2), em diferentes sistemas de expressão e condições de cultivo. Métodos: Foram utilizadas células S2 expressando a RVGP na membrana celular utilizando promotor induzível (S2MtRVGP-imm) ou constitutivo (S2AcRVGP-2) e expressando o ectodomínio da RVGP na forma solúvel, utilizando um promotor induzível (S2BipMt_RVGP-Ecto) estabelecidas em trabalhos anteriores. As células S2BipMt_RVGP-Ecto foram cultivadas em frasco schott, e as células S2MtRVGP-imm foram cultivadas em frascos schott e em spinner, em ambos os casos variando o tempo e a indução da expressão. As células S2AcRVGP-2 foram cultivadas em biorreator de bancada, em modo descontínuo ou descontínuo alimentado com suplementação de glutamina. Uma metodologia para purificação da rRVGP expressa na membrana celular (rRVGP-S2Mt e rRVGP-S2Ac) foi estabelecida por cromatografia de imunoafinidade utilizando um anticorpo monoclonal comercial ligado à coluna HiTrap NHS-activated HP (GE). O ectodomínio solúvel (rRVGP-S2Ecto) foi purificado por cromatografia de afinidade por metal imobilizado (IMAC-Ni+2). O padrão de glicosilação foi analisado por cromatográfica de interação hidrofóbica (HILIC) ou por cromatográfica do tipo HILIC associada a espectrometria de massas (UPLC-FLRMS/ MS). Resultados: Para as células S2BipMt_RVGP-Ecto, a variação na concentração de indutor apresentou efeito biológico que refletiu no crescimento e na produção da rRVGP. A concentração de indutor e a concentração de células na hora da indução resultaram em aumento da velocidade de produção da rRVGP por células S2MtRVGP-imm. O cultivo em frascos do tipo spinner resulta numa maior produção de rRVGP-S2Mt quando comparado com frascos do tipo schott. A estratégia de diminuição da concentração inicial de glutamina com suplementação durante o cultivo de células S2AcRVGP-2 reduziu a formação de amônio após o fim da exponencial, influenciando no crescimento e na produção de rRVGP. A metodologia de purificação por cromatografia de imunoafinidade gerou amostras com alto grau de pureza, com eficiência de até 99% em RVGP na forma trimérica para a rRVGP-S2Mt. Para a rRVGPS2Ac a mesma metodologia funcionou de maneira menos eficiente e com menor grau de pureza, devido a diferenças estruturais entre as duas proteínas. A IMAC-Ni+2, utilizada para rRVGP-S2Ecto, apresentou baixo índice de pureza possivelmente devido à baixa quantidade de glicoproteína expressa. Quanto as análises do padrão de glicosilação, as amostras rRVGP-S2Ecto apresentaram em maior proporção as estruturas paucimanosídicas F(6)M2, M3 e F(6)M3. Nas amostras rRVGP-S2Mt as estruturas F(6)M2 e M3 foram detectadas em maior proporção. As amostras rRVGP-S2Ac apresentaram maior proporção das estruturas M2, F(6)M2 e M3. Conclusões: O aumento das concentrações de indutor e de células no momento da indução apresenta efeito biológico, influenciando na velocidade de expressão de rRVGP. A velocidade específica de produção de rRVGP influencia diretamente na diminuição do processamento das N-glicanos. Além disso, os diferentes modos de cultivo utilizados resultaram em variação no padrão de glicosilação, sendo a que a diminuição drástica da glutamina inicial resultou num aumento de glicoformas com cinco ou mais resíduos de manose.Dados abertos - Sucupira - Teses e dissertações (2019

Mutant construction for ychO, luxS and qseC genes present in an Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) : in vivo and in vitro analysis

Orientador: Wanderley Dias da SilveiraDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Linhagens de Escherichia coli patogênica para aves causam doenças extraintestinais em aves, levando a perdas econômicas consideráveis para a indústria avícola em todo o mundo. Fatores de virulência ainda não conhecidos podem apresentar papéis importantes na patogenicidade, os quais podem ser significativos para o desenvolvimento de medidas de controle de processos infecciosos dessas linhagens. Invasinas permitem que o patógeno invada células hospedeiras, sobrepujando as defesas do hospedeiro, por interagir com receptores específicos na superfície celular. Baseando-se em análises do genoma da linhagem APEC SEPT362, detectou-se a presença de uma provável invasina, homóloga ao gene ychO, ainda não caracterizado, da linhagem E. coli str. K-12 substr. MG1655, sendo seu efeito na patogenicidade estudado. Neste trabalho, a linhagem SEPT362 deficiente para ychO reduziu a taxa de mortalidade em pintos, a adesão a células de fibroblasto de embrião de galinha (FEG), a invasão em células fibroblasto de embrião de galinha (CEC-32), a sobrevivência em macrófagos de aves (HD11), a formação de biofilme e a motilidade. Esses resultados sugerem, pela primeira vez, que o gene ychO codifica para uma invasina e que tem papel na patogenicidade da linhagem APEC SEPT362. Além dos diversos fatores de virulência, o estudo de diferentes tipos de sinais extracelulares que medeiam a comunicação entre bactérias e regulam a expressão gênica abre grandes possibilidades no estudo de mecanismos de patogenicidade e possíveis meios de interferir nos mesmos, transformando organismos patogênicos em organismos não virulentos. Quorum sensing (QS) é um mecanismo dependente da densidade celular bacteriana que as permitem agir como complexos multicelulares, aumentando suas chances de sobrevivência no meio ambiente. O sistema QS autoindutor 2 (AI-2) é um sistema de comunicação universal de bactérias mediado pelo AI-2, produzido pela ação da enzima LuxS. O sistema QS autoindutor 3 (AI-3) é um sistema que pode também mediar a comunicação entre reinos, sendo regulado pela hisitidina quinase QseC. Neste contexto, mutantes para os genes luxS e qseC foram construídos na linhagem SEPT362. A linhagem deficiente para luxS apresentou uma redução significativa na adesão a células FEG, devido a um papel do gene na regulação da fímbria do tipo 1. A linhagem deficiente para qseC teve uma menor taxa de mortalidade em pintos e uma redução significativa na adesão a células FEG, pela falta da fímbria do tipo 1 no mutanteAbstract: Avian pathogenic Escherichia coli strains cause extraintestinal diseases in poultry, leading to substantial economic losses to the poultry industry worldwide. Virulence factors not yet known may play important roles in pathogenicity, which may be significant for measures control development of infectious processes of these strains. Invasins allow the pathogen to invade host cells, overcoming host defenses by interacting with specific cell surface receptors. Based on analysis of APEC SEPT362 strain genome detected the presence of a putative invasin gene homologous to ychO, not yet characterized, of E. coli str. K-12 substr. MG1655, and its effect on pathogenicity was studied. In this work, the SEPT362 strain deficient for ychO reduced the mortality rate in chicks, the adherence to chicken embryo fibroblast (CEF) cells, the invasion of chicken embryo cells (CEC-32), the survival in poultry macrophages (HD11), the motility and biofilm formation. These results suggest, for the first time, that ychO gene encodes for an invasin and plays a role in APEC SEPT362 pathogenicity. In addition to the many virulence factors, the study of different types of extracellular signals that mediate communication between bacteria and regulate gene expression opens up great possibilities to study pathogenic mechanisms and possible ways to interfere in it, transforming pathogenic organisms into non-virulent organisms. Quorum sensing (QS) is a mechanism dependent on the bacterial cell density that enables them to act as multicellular complexes, increasing their chances of survival in the environment. The QS system autoinducer 2 (AI- 2) is a universal communication system of bacteria mediated by AI- 2 produced by the action of the enzyme LuxS. The QS system autoinducer 3 (AI- 3) is a system that can also mediate communication between realms, being regulated by kinase QseC. In this context, mutants for the luxS and qseC genes were built in SEPT362 strain. The strain deficient for luxS showed a significant reduction in CEF cell adhesion due to a role in the regulation of gene type 1 fimbriae. The deficient strain for qseC had a lower rate of mortality in chicks and a significant reduction in cell adhesion to CEF, due to a lack of type 1 fimbriae in the mutantMestradoGenetica de MicroorganismosMestra em Genética e Biologia Molecula

In vivo influence of in vitro up-regulated genes in the virulence of an APEC strain associated with swollen head syndrome

Avian Pathogenic Escherichia coli is responsible for significant economic losses in the poultry industry by causing a range of systemic or localized diseases collectively termed colibacillosis. The virulence mechanisms of these strains that are pathogenic in poultry and possibly pathogenic in humans have not yet been fully elucidated. This work was developed to study if over-expressed genes in a microarray assay could be potentially involved in the pathogenicity of an Avian Pathogenic Escherichia coli strain isolated from a swollen head syndrome case. For this study, five over-expressed genes were selected for the construction of null mutants [flgE (flagellar hook), tyrR (transcriptional regulator), potF (putrescine transporter), yehD (putative adhesin) and bfr (bacterioferritin)]. The constructed mutants were evaluated for their capacity for the adhesion and invasion of in vitro cultured cells, their motility capacity, and their pathogenic potential in one-day-old chickens compared with the wild-type strain (WT). The Delta bfr strain showed a decreased adhesion capacity on avian fibroblasts compared with WT, in the presence and absence of alpha-D-mannopyranoside, and the Delta potF strain showed decreased adhesion only in the absence of alpha-D-mannopyranoside. The Delta tyrR mutant had a reduced ability to invade Hep-2 cells. No mutant showed changes in invading CEC-32 cells. The mutants Delta flgE and Delta tyrR showed a decreased ability to survive in HD-11 cells. The motility of the mutant strains Delta bfr, Delta yehD and Delta potF was increased, while the Delta tyrR mutant showed reduction, and the Delta flgE became non-motile. No mutant strain caused the same mortality of the WT in one-day-old chickens, showing attenuation to different degrees45194105FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP2010/50596-