Prozessentwicklung für das Wachstum von Torfmoosen in Bioreaktoren zur groß-skaligen Biomasseproduktion

Die Wiederaufforstung der abgetorften Moorflächen in Deutschland benötigt eine große Menge an Torfmoos-Saatgut, welche aus den Naturreservaten nicht sofort gedeckt werden kann. Die Bereitstellung der ausreichenden Torfmoosbiomasse kann in Photobioreaktoren realisiert werden. Zu einer optimalen Vermehrung von Torfmoosen im Bioreaktor ist es notwendig, zunächst die Kultivierungsparameter zu finden, welche das Wachstum der Torfmoose und ihre Produktivität unter in-vitro Bedingungen beeinflussen. In von unten beleuchteten 500 mL Schüttelkolben gelang es, wichtige biologische Aspekte für die in-vitro Vermehrung von S. palustre sowie S. rubellum aufzudecken. Bislang war eine Kultivierung von Sphagnen im anorganischen Knop-Medium nicht realisierbar. Mit einer kontinuierlichen Begasung (0,1 vvm, x (CO2)=1 %) war es möglich, S. palustre reproduzierbar zu kultivieren. Fünfwöchige Kultivierungen im anorganischen Knop-Medium mit 1,25 mmol·L-1 NH4NO3 bei einer Photonenflussdichte (PFD) von 100 μmol·m-2·s-1 produzierten eine durchschnittliche Biomassekonzentration von 6,85 ± 0,62 gBTM∙L-1. Bei einem wöchentlichen Medienwechsel (Knop-Medium 20 % (v/v), VM= 250 mL) ließen sich auch weitere Torfmoos-Spezies wie S. rubellum in-vitro im Schüttelkolben vegetativ vermehren und vergleichsbare Biomassekonzentration (c(BTM)=5,97± 0,41 g∙L-1) wie der S. palustre erreichen. Für das photoautotrophe Wachstum benötigte S. palustre 1 % des CO2 im Zugas (v/v) bei einer Photonenflussdichte von 100 μmol·m-2·s-1, während bei PFD = 200 μmol·m-2·s-1 der molare CO2-Anteil im Zugas mindestens 2 % betragen musste, um das Wachstum von Torfmoosen zu stimulieren. Die reine Luftbegasung der Mooskultur unabhängig von der getesteten eingestrahlten Photonenflussdichte (100 - 200 μmol·m-2·s-1), zeigte sich für die Biomasseproduktion als nicht ausreichend. Eine Erhöhung der Lichtverfügbarkeit (200 → 500 μmol∙m-2·s-1) verbesserte nicht die Biomasseproduktion, sondern traten Chloropyllabbauerscheinungen auf. Die spektrale Zusammensetzung der LED-Module zur künstlichen Beleuchtung der Mooskultur war ein wichtiger Parameter für das Wachstum von S. palustre. Eine minimale Photonenflussdichte von 18,9 μmol·m-2·s-1 im Blaubereich (λ=430 und 490 nm) war notwendig, um das Wachstum von S. palustre zu stimulieren. Daher eigneten sich die kaltweißen LEDs statt der Warmweißen für das Wachstum von Torfmoosen mit künstlicher Beleuchtung. Eine Dauerbeleuchtung war nicht erforderlich und ähnliche Biomassekonzentration wurden bei einem Hell/Dunkel-Zyklus von 16/8 (h·h-1) erreicht. Zwei unterschiedliche Stickstoffquellen (Ammonium und Nitrat) waren für das Wachstum von S. palustre essentiell. Das Wachstum von S. palustre im Knop-Medium mit Nitrat als N-Quelle (c(KNO3) = 10,94 mmol·L-1) erwies sich als nicht zufriedenstellend, sowie eine Ammoniumkonzentration von 10,94 mmol·L-1 war für das Moos toxisch. Neben der Produktivität wirkte sich die Ammoniumkonzentration auf die Morphologie der Mooskultur aus, welche durch eine sphärische Struktur mit mehreren Capitula und reduziertem Längenwachstum gekennzeichnet war. Darüber hinaus zeigte sich, dass die Stickstoffquellen den Pigmentgehalt beeinflussen, wobei eine Senkung des Gehalts an Chlorophyll mit Nitrat als einzige N-Quelle auftrat. Die übliche pH-Senkung im Knop-Medium war auf die Ammonium-Aufnahme zurückzuführen und nicht auf den Kationenaustausch an der Zellwand der Moospflanze. Die Verringerung des pH-Wertes war für das Wachstum von Torfmoosen nicht notwendig, da eine Kultivierung bei einem konstanten pH-Wert durch Zugabe eines Puffers (Piperazin-1,4-bis(propansulfonsäure) die produzierte Biomasse nicht signifikant beeinflusste. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde der neue Ausgangspunkt für die weitere Optimierung der Prozessparameter von S. palustre in Submerskultur im Batchprozess bestimmt: LED-Beleuchtung durch kaltweiße LEDs, mit einer PFD=200 μmol·m2·s-1, 16/8 Hell- Dunkel-Zyklus; Begasung mit einem molaren CO2-Anteil von 2 % im Zugas und einer Begasungsrate von 0,08 vvm; 1,0faches Knop-Medium mit 1,25 mmol·L-1 NH4NO3 mit einem Anfang-pH-Wert von 4,0. Bislang war ein kontrollierter emerser Photobioreaktor zur Torfmooskultivierung, der auf den Kultivierungsbedingungen im Hochmoor basiert, nicht bekannt. Auf Grundlage des Konzepts des Trickle-Bed-Reaktors wurde ein 1,5 L emerser Photobioreaktor (Moosbettreaktor) entwickelt, welcher eine axenische Kultivierung unter kontrollierten Bedingungen (PFD, Temperatur, CO2) ermöglichte. Im Moosbettreaktor wuchsen die Torfmoose auf einem wasserdurchlässigen Speichervlies aus Polypropylen und wurden von unten stündlich mit Medium versorgt. Die Nährstoffzufuhr der Torfmoosbiomasse von oben mittels einer Zerstäubungsdüse war für S. palustre schädlich. Das für die Photosynthese benötigte CO_{i2} wurde am Reaktorboden eingeleitet und nach dessen Durchströmen der Torfmoosschicht, zusammen mit dem produzierten Sauerstoff von oben aus dem Reaktor ausgetragen. Die Energiequelle für das photoautotrophe Wachstum von Torfmoosen wurde von oben von einem Lichtmodul bereitgestellt, des mit kaltweißen LEDs ausgestattet war. Der Moosbettreaktor ermöglichte es, das Torfmoos S. palustre, sowie die zwei anderen Moosspezies S. rubellum und S. fimbriatum, welche langsam in Submerskultur im Batchverfahren wuchsen, emers und axenisch zu kultivieren. Bei einer Dauerbeleuchtung mit einer PFD von 200 μmol·m-2·s-1 und einer Begasungsrate von 25 mL∙min^-1 mit x(CO2)=2 % erreichte S. palustre eine durchschnittlichen Längenzuwachsrate von 0,17 cm·d^-1, S. rubellum von 0,09 cm·d^-1 und S. fimbriatum von 0,20 cm·d^-1. Als Kulturmedium wurde 0,2faches Knop-Medium mit 0,25 mmol·L-1 NH4NO3 mit einem Volumen von 800 mL verwendet und um 0,216 g∙L-1 Mg(NO3)2 erweitert, um den Chlorophyllabbau in den oberen Moosschichten zu vermeiden. Unter diesen Bedingungen zeigte der Moosbettreaktor eine hohe Flächenproduktivität von 12,6 gBTM∙m-2∙d-1 (312 gFM∙m-2∙d-1 ) im Vergleich zum Freilandmooswachstum. Mit dem entwickelten Reaktorsystem ist es gelungen, die Moose in einem ausdifferenzierten Zustand in einem kompakten Moosteppich wachsen zu lassen. Der Moosbettreaktor eröffnet die Möglichkeit zur kostengünstigen Produktion von Torfmoosbiomasse mit naturnaher Morphologie, da nur niedrige Betriebskosten, welche lediglich durch die Begasung zum Gaseintrag bestimmt werden, erwartet werden. Darüber hinaus hat der Moosbettreaktor das Hochskalierungspotenzial durch Stapeln baugleicher Reaktoretagen. Anschließend wurde im Rahmen diese Arbeit die Produktion von Torfmoospflanzen mit vielen Innovation und Capitula im Labormaßstab fokussiert, weil sich Pflanzen mit dieser Morphologie für die Aussaat am besten eignen. In einem horizontal betriebenen 5 L Wave-Photobioreaktor betrug die volumetrische Produktivität 2,8 gFM ·L-1·d-1 und die Moose wuchsen in sphärischer Struktur mit vielen Innovationen. Trotz der erfüllten Saatgutqualität ist dieser Reaktortyp für die zukünftige groß-skaligen Torfmoosproduktion aufgrund der hohen Betriebskosten und eingeschränkten Maßstabvergrößerung ungeeignet. Die zweite Alternative eines submersen Kultivierungssystems zur Maßstabvergrößerungen war der vertikal aufgebaute 60 L Schlauchreaktor aus der Mikroalgenkultivierung. Im Reaktor wuchs das Torfmoos S. palustre unter konstanter Temperatur im offenen Betrieb, wobei auf die Autoklavierung des Mediums (anorganisches 1,0faches Knop-Medium mit 1,25 mmol·L-1 NH4NO3) verzichtet wurde. Ein LED-Lichtmodul, bestehend aus kaltweißen LEDs, beleuchtete den Reaktor ganztätig mit einer PFD=200 μmol·m-2·s-1. Begast wurde mit einer Begasungsrate von 0,03 vvm und mit einem x(CO2)=2 %. So erzeugte der Schlauchreaktor Torfmoosbiomasse mit vielen Capitula. Da im Schlauchreaktor wesentlich weniger Turbulenz vorliegt, entstanden lockere Moosstrukturen. Die erreichte Produktivität von 0,02 gBTM∙L-1∙d-1 (0,43 gFM∙ L-1∙d-1) war jedoch gering, da die Torfmoose durch die Gasblasen starken Auftrieb erfuhren und dadurch nicht die gesamte Leuchtfläche zum Wachstum nutzen konnten. Trotz der Tatsache, dass sich der Schlauchreaktor in Hinsicht auf die Produktivität als nicht zufriedenstellend erwies, sollte dieser Reaktortyp zur Produktion von Torfmoosbiomasse weiterverfolgt werden. Erstens unterscheidet sich der Schlauchreaktor grundlegend von vorhandenen submersen Photobioreaktoren, bei denen die Maßstabvergrößerung technisch nicht möglich ist. Die Erhöhung der Produktionskapazität kann durch Reihenkultivierung der einzelnen Schlauchreaktoren realisiert werden, ohne die Lichtverhältnisse im Reaktor negativ zu beeinflussen. Zweitens kann die volumetrische Produktivität erhöht werden, indem Konzepte des Airliftreaktors mit verbesserter axialer Durchmischung in das System integriert werden und die Kultivierung als Fed-Batch mit sequenzierter Teilernte erfolgt. Es zeigte sich, dass S. palustre in der Lage ist, in verschiedenen Reaktortypen zu wachsen, und dass sich alle drei getesteten Reaktortypen für die Herstellung von Torfmoosbiomasse im kleinen Maßstab eignen. Die verschiedenen Verhältnisse innerhalb der Photobioreaktoren rufen Variationen der Torfmoosmorphologie hervor, die vermutlich auf die unterschiedlichen Licht- und Krafteinwirkung zurückzuführen sind. Je nach erwünschter Saatgutqualität können die drei vorgestellten Photobioreaktoren weiterentwickelt und hochskaliert werden, um für die zukünftige industrielle Torfmoosproduktion verwendet zu werden

Medium optimization for biomass production of three peat moss (Sphagnum L.) species using fractional factorial design and response surface methodology

Peat moss (Sphagnum) biomass is a promising bioresource of renewable material to substitute peat in growing media. For sustainable production on a large scale, the productivity of Sphagnum mosses has to be increased by optimizing culture conditions. Optimization was achieved using experimental design to determine concentrations of eight factors leading to highest biomass yield. We improved an established Sphagnum medium by reducing the concentrations of NH$_{4}$NO$_{3}$, KH$_{2}$PO$_{4}$, KCl, MgSO$_{4}$, Ca(NO$_{3}$)$_{2}$, FeSO$_{4}$ and a microelement solution up to 50%. Together with sucrose concentrations of 16 g L$^{-1}$ for Sphagnum fuscum and 20 g L$^{-1}$ for Sphagnum palustre and Sphagnum squarrosum, moss productivities were enhanced for all tested species in shake flasks. Further upscaling to 5 L photobioreactors increased the biomass yield: 15 g freshweight resulted in about 630 g for S. fuscum (50-fold), 580 g for S. palustre (40-fold) and 400 g for S. squarrosum (25-fold) in 24 days